肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的肿瘤之一。2015年，中国超过30万人死于HCC，其致死率在肿瘤相关死亡病例中位居第2位，仅次于肺癌，严重危害了人类的生活质量和生命健康[1]。尽管诊疗水平不断提高，手术切除仍是HCC治疗的主要手段，HCC患者术后5年的生存率有所提高，但是术后癌细胞的转移仍是HCC预后的重要影响因素[2]。HCC的转移是一个复杂的过程，它涉及大量基因异常表达以及相关信号通路的异常。肿瘤细胞获得转移和侵袭能力的主要途径就是上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，其主要的特征表现为上皮型标志物如E-钙黏蛋白(E-cadherin)的缺失或下调，以及间质型标志物如神经-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的获得和上调[3-4]。目前，用于抗肝癌药物反应性较低，易产生抗药性，且药物毒性大，HCC的预后仍不乐观，如何有效改善HCC的预后仍面临巨大的挑战。越来越多研究提示，天然药物来源的单体化合物在肿瘤的治疗上可能具有重要前景[5]。
人参皂苷CK(ginsenoside metabolite compound K)结构见Fig 1，是天然二醇型人参皂苷(如人参皂苷Rb1、Rb2、Rc等)在人肠道细菌作用下的主要降解产物，根据皂苷元母核，其结构属四环三萜达玛烷型人参皂苷，是人参皂苷在体内吸收和发挥活性作用的主要形式，具有抗炎、保护肝脏、减轻骨髓抑制、改善免疫功能等药理活性[6]。有研究表明，人参皂苷CK通过抑制PI3K/Akt/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信号通路，抗脑胶质瘤细胞增殖，促进其凋亡[7]。另外，人参皂苷CK可诱导肝癌细胞凋亡，其作用机制可能与下调p53蛋白表达和降低Bcl-2/Bax比例有关[8]。然而，人参皂苷CK对HCC侵袭转移的影响尚未见报道。本实验探讨人参皂苷CK对人肝癌细胞HepG2迁移及侵袭能力的影响，并进一步探究其可能的作用机制。
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| Fig 1 Chemical structural formula of ginsenoside CK |
人肝癌细胞HepG2由本实验室冻存。于37℃水浴中复苏，再将细胞转移至培养瓶中，加入适量含10%胎牛血清的培养基，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
1.2 药物与试剂DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)高糖培养基：美国Gibco公司；人参皂苷CK：分子质量622.18，由浙江海正制药有限公司提供，用PBS溶解，用培养液稀释成不同浓度；MTT：Sigma公司；Matrigel基质胶：美国BD公司；RIPA蛋白裂解液、Western一抗、二抗稀释液、胰蛋白酶：江苏碧云天公司；预染蛋白质分子量标准：美国Thermo公司；抗p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、N-cadherin、E-cadherin抗体：美国Cell Signaling Technology公司；抗β-actin抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)：北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL化学发光试剂盒：美国Pierce Biology公司。
1.3 仪器洁净工作台：江苏苏州安泰空气技术有限公司；CO2细胞培养箱：Thermo Fisher Scientific公司；Infinite M1000 PRO多功能酶标仪：瑞士Tecan公司；Powerpac164-5070电泳仪：美国Bio-Rad公司；LAS4000Mini型化学发光成像分析仪：美国GE公司；BX53正置显微镜、IX-71荧光倒置显微镜：日本Olympus光学工业株氏会社产品。
2 方法 2.1 MTT法检测细胞活力将处于对数生长期的HepG2细胞制成单细胞悬液并计数, 使细胞数约为5×107·L-1，接种于96孔板，每孔加200 μL细胞悬液；放置在37℃、5% CO2细胞培养箱中；待细胞贴壁后，在96孔板中加入不同浓度人参皂苷CK(0、10、20、40、80 μmol·L-1)，每组6个复孔，放置在培养箱中培养24 h；培养结束前4 h，取出96孔板，每孔加入20 μL浓度为5 g·L-1的MTT溶液；放入培养箱继续孵育4 h；培养结束后吸出上清，每孔加入150 μL DMSO，避光，在水平振荡仪上震动10 min；用酶标仪检测各组在490 nm处的OD值，绘出细胞活力柱状图。
2.2 细胞划痕实验检测细胞迁移能力将处于对数生长期的HepG2细胞制成单细胞悬液，计数，接种于6孔板，使每孔细胞数约为1×106个；放置在37℃、5% CO2细胞培养箱中；待细胞贴壁后，细胞汇合度约为80%时，换为无血清的DMEM培养，每孔用枪头划出3道竖线，在光学显微镜下观察，拍摄各孔细胞0 h时，细胞划痕的初始状态；之后在6孔板中加入不同浓度的人参皂苷CK(0、20、40、80 μmol·L-1)，放入培养箱中培养至24 h时后取出，在光学显微镜下拍摄各组细胞划痕的状态。计算细胞24 h迁移率。迁移率=(划痕面积0 h -划痕面积24 h)/划痕面积0 h
2.3 Transwell实验检测细胞侵袭能力将Transwell小室放于24孔板中，在Transwell下室中加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，并分别加入不同浓度的人参皂苷CK(0、20、40、80 μmol·L-1)；将Matrigel胶放入冰箱中隔夜使其解冻，在Transwell小室表面铺100 μL用DMEM稀释的Matrigel，放在培养箱中孵育2 h，使形成一层基质屏障膜；将处于对数生长期的HepG2细胞制成单细胞悬液，计数，接种于Transwell小室，每孔细胞数约为2×104个，细胞用无血清的培养基进行培养；放入细胞培养箱，培养48 h；取出Transwell小室，PBS轻轻漂洗2遍，用结晶紫染色；PBS冲洗，Transwell上室中未迁移的细胞用棉签轻轻擦去；在倒置显微镜下观察，对膜底细胞进行拍照、计数、统计学分析。
2.4 Western blot实验将处于对数生长期的HepG2细胞制成单细胞悬液，计数，种于6孔板，每孔细胞数约为1×106个；待细胞贴壁后，培养至80%融合后，换无血清培养基同步化；之后在6孔板中加入不同浓度的人参皂苷CK(0、20、40、80 μmol·L-1)，放入培养箱中培养24 h；弃去培养基，用PBS洗涤2次；加入细胞裂解液，用细胞刮轻轻刮下贴壁细胞，吸至EP管中，4 ℃、15 000 r·min-1离心15 min，吸取上清得到细胞总蛋白，BCA法进行蛋白定量；进行SDS-PAGE电泳，转膜；用含0.05%吐温20的PBS(TPBS)配制5%脱脂奶粉，封闭PVDF膜，放置于37℃摇床中2 h；将PVDF膜加入按1 :1 000稀释的β-actin、p-ERK、ERK、p-Akt、Akt、E-cadherin、N-cadherin抗体中，4 ℃摇床孵育过夜；加入按适当比例稀释后的二抗，37 ℃孵育2 h；将ECL显影液(A液:B液=1 :1)均匀涂布于膜上条带相应位置，于LAS4000Mini型化学发光成像分析仪中曝光；采用Image J图像分析软件进行结果分析，测得条带的灰度值，计算各组的目的条带和内参的比值，比较各组间差异。
2.5 统计学分析采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计处理，数据以x±s表示，计量资料的组间差异比较采用One-Way ANOVA。
3 结果 3.1 人参皂苷CK抑制肝癌细胞的活力Fig 2 MTT结果显示，不同浓度的人参皂苷CK作用后，与对照组(0 μmol·L-1人参皂苷CK)相比，10 μmol·L-1人参皂苷CK组HepG2细胞活力并无明显变化。人参皂苷CK浓度增加至20~80 μmol·L-1时，人肝癌细胞HepG2的活力受到明显抑制。
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| Fig 2 Effect of ginsenoside CK on viability of HepG2 cells(x±s, n=6) **P < 0.01 vs control group |
使用细胞划痕法检测人参皂苷CK对人肝癌细胞HepG2迁移能力的影响。与对照组(0 μmol·L-1人参皂苷CK)相比，人参皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)能明显抑制人肝癌细胞HepG2的迁移(Fig 3)。
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| 图 3 Effect of ginsenoside CK on migration of HepG2 cells (x±s, n=6) A: Cell wound healing assay was used to detect effect of ginsenoside CK on migration of HepG2 cells; B: Quantitative analysis showed the percentage wound closure relative to different groups using Adobe Photoshop Elements 6.0 software. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
Transwell侵袭实验结果显示(Fig 4)，与对照组(0 μmol·L-1人参皂苷CK)相比，人参皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)明显抑制人肝癌细胞HepG2的穿膜细胞数。提示人参皂苷CK能抑制人肝癌细胞HepG2的侵袭。
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| Fig 4 Effect of ginsenoside CK on invasion of HepG2 cells (x±s, n=6) A: Cell transwell assay was applied to detect effect of ginsenoside CK on cell invasion of HepG2 cells; B: Quantitative analysis showed the number of cells on transwell chamber membrane. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
EMT在HCC的侵袭转移过程中起着关键的作用。通过EMT进程，细胞获得较高的迁移、侵袭和降解细胞外基质的能力。Western blot结果显示(Fig 5)，与空白对照组相比较，HepG2细胞中N-cadherin蛋白表达水平随给药浓度增高而下降，而E-cadherin蛋白表达水平逐渐升高。结果提示人参皂苷CK可能调控人肝癌HepG2细胞的EMT进程。
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| Fig 5 Effect of ginsenoside CK on marker of EMT(x±s, n=3) A: Western blot of N-cadherin and E-cadherin expression in HepG2 cultured with ginsenoside CK at the various concentrations; B: The semi-quantitative analysis of N-cadherin and E-cadherin expression in various groups. The band intensity of N-cadherin and E-cadherin was quantified by densitometry and normalized to β-actin. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
Western blot检测显示(Fig 6)，与空白对照组相比较，人参皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)作用于HepG2细胞24 h后，ERK、Akt蛋白的表达无明显变化，而p-ERK、p-Akt的表达明显降低，p-ERK/ERK、p-Akt/Akt的比值明显降低。提示人参皂苷CK可抑制ERK、Akt的磷酸化。
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| Fig 6 Effect of ginsenoside CK on expression of p-Akt and p-ERK proteins(x±s, n=3) A: Western blot of p-Akt and p-ERK expression in HepG2 cultured with ginsenoside CK at the various concentrations; B: The semi-quantitative analysis of p-Akt and p-ERK expression in various groups. The band intensity of p-Akt/Akt and p-ERK/ERK was quantified by densitometry. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
HCC初期病情隐匿，无明显症状，一旦出现症状前来就诊者，其病程大多已进入中晚期。这个阶段的HCC，癌细胞可能已经发生侵袭转移，出现多个病灶。目前，除手术切除和化药辅助治疗外，HCC治疗领域缺少疗效好、副作用小的治疗药[9]。相关研究表明，人参皂苷CK能抑制人结肠直肠癌细胞系HCT-116的增殖，促进细胞凋亡，也能抑制鼠神经胶质瘤细胞C6的转移[10-11]。本研究发现，人参皂苷CK可抑制HepG2细胞的增殖、迁移和侵袭，与抑制ERK和Akt信号，负性调节EMT有关。
研究发现，肿瘤侵袭转移的关键是肿瘤细胞获得侵袭性，脱离原发灶形成游离细胞，而EMT在此过程中发挥了重要的作用。EMT现象被认为是影响肝癌细胞发生侵袭转移的机制之一。上皮细胞通过发生EMT，获得成纤维样细胞的特征，包括细胞形态改变、黏附减弱、细胞活性增强。通常当E-cadherin表达缺失，肿瘤细胞易脱离原发灶形成游离细胞，导致肿瘤细胞原位浸润性及迁移游走[12]。N-cadherin在EMT过程中表达增加。与E-cadherin不同，在间质型细胞中，N-cadherin加强肿瘤细胞运动和转移的能力，并且其介导肿瘤细胞的侵袭作用可超过介导细胞间的黏附作用[13]。因此，EMT与恶性肿瘤的侵袭转移密切相关。相关研究表明，细胞发生EMT现象时，肿瘤细胞中E-cadherin表达降低，而N-cadherin、Vimentin表达升高。本研究发现，人参皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)抑制了HepG2细胞的迁移及侵袭能力；与对照组(0 μmol·L-1人参皂苷CK)相比，人参皂苷CK(20、40、80 μmol·L-1)作用的HepG2细胞中E-cadherin蛋白表达水平升高，N-cadherin蛋白表达水平下降。提示人参皂苷CK可能调控的人肝癌HepG2细胞的EMT进程。
目前，已知的诱导和调控EMT的因素很多，其信号调控是个十分复杂的网络。ERK1/2及PI3K/Akt是调控细胞增殖、分化、凋亡的重要通路，而这些通路的持续活化与HCC的发生发展密切相关[14-15]。相关实验表明，PI3K/Akt、ERK通路过度活化会促进HCC的EMT进程[16-17]。目前，尚不清楚人参皂苷CK是否能通过ERK、PI3K/Akt通路参与调控EMT进程。本实验通过检测人参皂苷CK不同浓度给药组ERK、Akt通路蛋白表达情况发现，人参皂苷CK能降低p-ERK/ERK和p-Akt/Akt的比值。由此推测，人参皂苷可能通过抑制ERK和Akt信号通路，负性调控肝癌细胞的EMT进程。
综上所述，人参皂苷CK可抑制肝癌细胞的迁移和侵袭过程，可能与抑制ERK和Akt信号有关。这些初步研究为人参皂苷CK后期的开发利用提供了实验依据。
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