2. 国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室，广东 广州 510006;
3. 广东高校中药质量工程技术研究中心，广东 广州 510006
2. Key Lab of Digital Quality Evaluation of Chinese Materia Medica of State Administration of TCM, Guangzhou 510006, China;
3. Engineering & Technology Research Center for Chinese Materia Medica Quality of the Universities of Guangdong Province, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
护肝片由柴胡、五味子、茵陈、板蓝根、猪胆粉及绿豆六味药材组成，其处方来源于《伤寒论》中的小柴胡汤和茵陈蒿汤。药理实验表明，护肝片有抗急性肝损伤的作用，可降低四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)肝损伤模型大鼠丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)[1]。
代谢组学是上世纪90年代中期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系受刺激或干扰后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的代谢途径的一种技术[2]。代谢组学技术为中医药的整体评价和研究提供了可能，已广泛用于中药及其复方的研究[3-4]。
本文采用1H-NMR技术分析CCl4急性肝损伤模型大鼠、正常大鼠、护肝片给药组大鼠的尿液和粪便成分谱变化，结合模式识别方法分类，寻找并解释标记物归属，联系机体代谢通路和代谢网络，阐述CCl4致大鼠急性肝损伤的尿液和粪便代谢轮廓变化及护肝片对相关代谢通路和潜在生物标志物的干预作用，为护肝片的保肝作用机制提供参考。
1 材料 1.1 动物Sprague-Dawley(SD)大鼠，♂，体质量180~200 g，购自广州中医药大学实验动物中心，SPF级，合格证号SCXK(粤)2013-0034。饲养环境光照每天12 h，温度(22±2)℃，湿度45%~55%。
1.2 药物与试剂护肝片(黑龙江葵花药业股份有限公司，批号：201609128)；四氯化碳(分析纯，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170102)；丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、碱性磷酸酯酶(alkaline phosphatase, ALP)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为：20170412、20170331、20170411和20170408)；磷酸盐缓冲液(PBS，美国Sigma公司，批号：K40104)；氘水(D2O，美国Sigma公司，批号：1001484275)。
1.3 仪器Bruker AVANCE Ⅲ 500 MHz全数字化超导核磁共振谱仪(瑞士Bruker公司)；AMS18全自动生化仪(北京奥普森公司)；1-14型低温离心机(德国Sigma公司)。
2 方法 2.1 分组与给药参考文献方法[1]，将36只♂ SD大鼠适应性喂养3 d后，随机分成正常组、模型组和护肝片组。护肝片组灌胃护肝片混悬液(0.5% CMC-Na溶解)，剂量为1.7 g·kg-1，正常组和模型组灌胃给予等体积的溶剂，每天1次，连续9 d。末次给药后1 h，模型组及护肝片组大鼠腹腔注射50% CCl4花生油溶液1 mL·kg-1，正常组腹腔注射等体积的花生油溶液。每组一半动物用于测量血清生化指标水平，另一半动物用于尿液和粪便代谢组学分析。
2.2 血清生化指标水平检测腹腔注射CCl4 24 h后，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，收集的血液样品经凝固(4℃，60 min)后离心(3 500 r·min-1，15 min，4℃)得到血清。AST、ALT、ALP和LDH酶活性测定严格按照试剂盒说明书操作。实验数据以x±s表示，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，多组均数间的两两比较采用Tukey检验。
2.3 尿液采集及预处理参考文献方法[5]，腹腔注射CCl4后，大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液。尿液收集时，代谢笼集尿器置于冰上，加入0.5 mL 2% NaN3溶液做防腐剂。400 μL尿液中加入200 μL磷酸缓冲液(0.2 mol·L-1 Na2HPO4-0.2 mol·L-1 NaH2PO4, pH 7.4)，静置20 min后离心(4 000 r·min-1, 15 min, 4℃)，取上清液500 μL加至5 mm NMR测试管中，再加入50 μL D2O(含有0.05% W/V TSP-d4)，振荡混匀，待测。
2.4 粪便提取及预处理参考文献方法[6]，100 mg粪便加入800 μL磷酸缓冲液(0.2 mol·L-1 Na2HPO4-0.2 mol·L-1 NaH2PO4, pH 7.4)和200 μL D2O(含有0.05% W/V TSP-d4)匀浆，匀浆液室温超声提取30 min后离心(12 000 r·min-1，10 min，4℃)，取上清液550 μL加至5 mm NMR测试管中，待测。
2.5 1H-NMR测定实验温度为298K，尿液和粪便样本均采用预饱和的1D NOESY脉冲序列压制水峰。尿液样本弛豫延迟时间3 s，采集时间3.28 s。粪便样本弛豫延迟时间2 s，采样时间1.64 s。尿液和粪便样本谱宽10 kHz，采样点数64 K，采集次数128次。
2.6 1H-NMR图谱处理及多变量数据分析采用线宽为0.3 Hz的指数窗函数进行傅立叶变换。运用软件MestReNova 6.1(西班牙Mestrelab Research公司)对所获谱图进行手动相位和基线校正后，参照TSP(δ 0.0)对1H-NMR谱的化学位移进行定标。在δ 0.5~9.5区域按δ0.01等间隔分段积分，然后将所得数据转换成ASCⅡ文件输出到Excel 2010中进行下一步处理。对于尿液和粪便样本，分别将区域δ 4.49~5.98和δ 4.70~5.15设为0积分段，在进行多变量数据分析之前对各分段积分值进行归一化处理，所得数据乘以10 000后导入SIMCA-P 12.0 (Umetrics AB, Umeå/Malmö, Sweden)，经Pareto标度化预处理后，进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。
3 结果 3.1 护肝片对CCl4致急性肝损伤大鼠血清ALT、AST、ALP、LDH水平的影响与正常组比较，模型组大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH水平均明显升高(P＜0.05)；与模型组比较，护肝片组大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH水平均明显降低(P＜0.05)，表明护肝片能明显回调CCl4致急性肝损伤大鼠血清中升高的AST、ALT、ALP、LDH水平，提示护肝片能有效预防急性肝损伤(Tab 1)。
| Group | AST/U·L-1 | ALT/U·L-1 | ALP/U·L-1 | LDH/U·L-1 |
| Control | 147.52±14.28* | 58.03±16.78* | 239.83±32.99** | 961.76±334.73* |
| Model | 224.74±21.80 | 119.93±10.65 | 308.39±45.23 | 2240.27±495.06 |
| HGT | 170.57±15.79* | 90.41±9.86* | 251.33±44.77** | 1346.19±581.58* |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | ||||
大鼠尿液和粪便的1H-NMR谱图如Fig 1、2所示。代谢物谱峰的归属主要依据化学位移值、峰的裂分情况、偶合常数及参考文献报道[7-8]。
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| Fig 1 1H-NMR spectra of rat urine A:Control group; B: Model group; C: Hugan Tablets group |
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| Fig 2 1H-NMR spectra of rat feces A:Control group; B:Model group; C:Hugan Tablets group |
如Fig 3A、3B所示，正常组和模型组的尿液和粪便样本点在PC1维可以完全区分开，说明CCl4诱导急性肝损伤后大鼠机体生理及物质代谢状况发生了明显的改变。本研究采用7倍交叉验证法对OPLS-DA模型的可靠性进行验证，得到了OPLS-DA模型的主要参数，尿液：R2X(cum)=0.86，R2Y(cum)=0.99，Q2(cum)=0.89；粪便：R2X(cum)=0.84，R2Y(cum)=0.97，Q2(cum)=0.84。从上述参数可以看出本研究建立的模型具有较高的可靠性。
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| Fig 3 OPLS-DA score plots derived from 1H-NMR spectra of rat urine (A, C) and feces (B, D) ▲: Control group; ●: Model group; ◆: Hugan Tablets group |
本研究使用OPLS-DA模型中变量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)和独立样本t检验来评价内源性代谢物相对峰面积在正常组和模型组间的差异。只有同时满足VIP>1和P＜0.05的代谢物才被认为是潜在的生物标志物。按照上述原则，最终在大鼠尿液和粪便中分别筛选得到7种和3种与急性肝损伤相关生物标志物(Tab 2、3)。
| Name of compounds | δ1H | VIP | Peak area after normalization | ||
| Control | Model | HGT | |||
| N-acetyl glycoproteins | 2.04(s) | 1.6 | 67.12±5.94* | 57.94±6.41 | 62.62±5.60 |
| 2-oxoglutarate | 2.44(t) | 4.1 | 110.85±50.79* | 52.60±28.19 | 106.48±24.70* |
| 3.01(t) | 4.4 | 135.27±53.81* | 69.01±34.71 | 120.66±31.12* | |
| Citrate | 2.55(d) | 2.9 | 76.51±27.59* | 45.17±20.94 | 68.44±11.86* |
| Creatinine | 3.05(s) | 6.0 | 247.46±21.85* | 383.53±142.16 | 263.90±36.01* |
| Trimethylamine N-oxide | 3.27(s) | 4.5 | 97.39±32.90* | 168.51±58.66 | 113.55±24.99* |
| Phenylacetylglycine | 7.35(m) | 2.4 | 13.89±2.44* | 28.17±5.57 | 23.28±4.63 |
| Hippurate | 7.56(t) | 2.8 | 32.31±4.44* | 14.24±4.41 | 20.01±3.72* |
| s, singlet; d, doublet; t, triplet; m, multiplet.*P＜0.05 vs model group | |||||
| Name of compounds | δ1H | VIP | Peak area after normalization | ||
| Control | Model | HGT | |||
| Butyrate | 0.90(t) | 3.0 | 53.92±12.46* | 40.56±5.86 | 52.70±7.61* |
| 1.56(m) | 3.2 | 46.05±10.11* | 32.23±6.33 | 42.84±8.84* | |
| Glucose | 4.65(d) | 3.0 | 18.22±7.12* | 6.41±3.03 | 14.66±5.58* |
| Uracil | 5.81(d) | 1.2 | 6.93±1.23* | 8.95±1.87 | 7.14±1.08* |
| 7.55(d) | 1.3 | 9.58±1.64* | 11.99±2.16 | 8.62±2.28* | |
| s, singlet; d, doublet; t, triplet; q, quartet, m, multiplet.*P＜0.05 vs model group | |||||
护肝片组样本点与模型组样本点可以完全分离，且与正常组样本点接近，表明护肝片能有效干预急性肝损伤(Fig 3C、3D)。同时，护肝片能分别使急性肝损伤大鼠尿液和粪便中5种和3种潜在生物标志物明显回调(Tab 2、3)。从上述结果可以看出，护肝片对CCl4致急性肝损伤大鼠尿液和粪便代谢紊乱能产生有效的干预作用。
4 讨论CCl4是经典的化学性肝毒剂，腹腔注射致大鼠肝损伤模型重现性好，既可以造成肝细胞实质性损伤，又可以引起肝功能异常。自由基的形成及引发的链式过氧化反应是CCl4所致肝损伤主要机制[9]，肝细胞受到自由基攻击，细胞膜通透性升高，导致细胞内酶释放，引起血清酶升高。
本实验通过CCl4诱导复制了SD大鼠急性肝损伤模型，AST、ALT、ALP、LDH存在于肝细胞中，当血清中上述指标升高时提示肝脏损伤。模型组较正常组大鼠血清中AST、ALT、ALP、LDH水平升高，而护肝片降酶保肝能力明显。
与前期报道相一致[10]，本研究通过尿液代谢组学研究发现，CCl4可引起机体三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)紊乱。TCA是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)和柠檬酸(Citrate)是三羧酸循环的重要中间产物。在三羧酸循环第一步反应中，柠檬酸合成酶(citrate synthase，CSY)可催化乙酰辅酶A的乙基与草酰乙酸的酮基结合生成柠檬酰辅酶A，以便后续高能硫酸键水解，释放出辅酶A，得到柠檬酸。而异柠檬酸转变成α-酮戊二酸时需要异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)的参与。上述反应均为不可逆反应，CSY与IDH均为反应中的限速酶[10]。在CCl4致大鼠急性肝损伤的情况下，α-酮戊二酸和柠檬酸水平明显降低，表明CCl4肝损伤引起三羧酸循环被破坏，这可能与大鼠接触CCl4后抑制CSY与IDH活性有关。而给予护肝片可以使α-酮戊二酸和柠檬酸水平明显升高，说明护肝片可调节三羧酸循环，其机制可能与提高CSY与IDH活性有关。
此外，马尿酸(hippurate)是由甘氨酸和苯甲酸在肝脏中结合生成，而苯甲酸主要是由肠道微生物代谢膳食中的芳香酸或多酚生成。肠道厌氧菌代谢苯丙胺生成苯乙酸，在肝脏中苯乙酸与甘氨酸结合生成苯乙酰甘氨酸(phenylacetylglycine)。胆碱在肠道菌群的作用下生成三甲胺，进而被肝脏黄素单加氧酶代谢成氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide)[11]。因此，模型组大鼠尿液中马尿酸水平降低，氧化三甲胺和苯乙酰甘氨酸水平升高，表明大鼠体内肠道菌群平衡被破坏。而护肝片能提高马尿酸水平和降低氧化三甲胺水平，说明其能通过调节肠道菌群代谢产生保肝作用。
粪便提取液中的代谢物作为肠道菌群和宿主共代谢的产物，不仅可以反映机体内肠道菌群的状态，而且具有丰富的代谢物信息，同时在共栖菌与宿主之间起着纽带作用。不易消化的碳水化合物是结肠微生物重要的能量来源，菌种如多形拟杆菌及卵形拟杆菌所含的糖苷酶和裂解酶基因是人的2倍多，它们能利用几乎所有的植物及宿主的聚糖(如黏蛋白相关的糖蛋白)，肠道微生物发酵产生的短链脂肪酸中丁酸(butyrate)最为重要，其在结肠上皮细胞中常作为细胞代谢的能量底物[12]。CCl4肝损伤模型大鼠粪便中葡萄糖(glucose)和丁酸水平降低，说明CCl4可能引起了肠道菌群结构与组成的变化，护肝片能逆转葡萄糖和丁酸的变化，表明护肝片可减轻肠道菌群紊乱。
综上所述，本研究采用1H-NMR检测灌服护肝片的CCl4急性肝损伤大鼠的尿液和粪便中内源性代谢物变化，对护肝片在体内的作用机制进行了初步探讨。护肝片能调节机体三羧酸循环和肠道菌群代谢，达到干预CCl4致急性肝损伤时代谢组学变化的作用，进而改善肝功能，减轻肝损伤。
( 致谢: 本文实验在广东药科大学实验中心、国家中医药管理局中药数字化质量评价技术重点研究室、广东高校中药质量工程技术研究中心完成，特别感谢实验中心吴霞老师的帮助。)
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