肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]。肺癌可分为小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小细胞肺癌约占80%~85%[2]。尽管近年来化疗、放疗以及手术治疗等常规疗法均有所进展，仍不能有效提高患者的5年生存率。因此，研究其发病机制尤为重要。
近年来，非神经元胆碱能信号通路与肿瘤的关系受到广泛关注。已有研究表明，多种肿瘤细胞均可合成和分泌乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)作为一种生长因子，作用于自身或邻近细胞上的烟碱型胆碱受体(nicotinic cholinergic receptors，NRs)和毒蕈碱型胆碱受体(muscarinic cholinergic receptors，MRs)，参与细胞的生长增殖、抵抗凋亡、血管发生、转移侵袭，促进癌症的进程[3-4]。mAChR属G蛋白偶联受体家族，存在M1~M5五种受体亚型[5]。mAChR的表达和过度激活已在肺癌、结肠癌、神经胶质癌和前列腺癌中报道[6-7]。Song等[8]研究证实，在SCLC细胞外源性给予ACh或卡巴胆碱可引起钙内流增加，此作用可被选择性M3R拮抗剂4-DAMP、达非那新(Darifenacin)完全阻断，应用M3R拮抗剂或敲减M3R可以引起小细胞肺癌MAPK和Akt磷酸化水平下降，M3R拮抗剂单独给药即可抑制SCLC细胞增殖，并降低裸鼠移植瘤MAPK磷酸化水平。而有关M3R和NSCLC的研究报道并不多，有研究指出，M3R表达可能与NSCLC肿瘤发展相关，并且M3R高表达与NSCLC患者不良预后相关[9-10]。
本研究拟观察拮抗M3R对H1299细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并探讨其可能的作用机制。M3R拮抗剂在临床上治疗慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)已经很长时间，具有很好的疗效和依从性[11]。如果在体外证实了M3R拮抗剂能够抑制NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭等，将有助于确认M3R是否可作为抗肿瘤靶标，尤其是为未来可能的NSCLC组合化疗策略选择提供依据。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂人非小细胞肺癌H1299细胞购自国家实验细胞资源共享平台(China Infrastructure of Cell Line Resource)；人非小细胞肺癌H460细胞购自中国科学院上海细胞库。RPMI 1640细胞培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自吉泰生物；BCATM Protein Assay试剂盒购自Thermo公司；M3R拮抗剂富马酸(R, R)-戊乙奎醚(R2-8018)由本所合成；胆碱能受体激动剂卡巴胆碱、M3R拮抗剂达非那新，均购自Sigma公司；星形孢菌素购自MCE公司；抗体均购自Cell Signaling Technology公司；Fluo-4，AM购自美国Life Technologies公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁株式会社化学研究所；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自康为世纪。
1.2 仪器CKX41倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；GENios Pro多功能酶标仪，澳大利亚Tecan公司；05PR-22冷冻离心机，日本HITACHI公司；MCO-15AC二氧化碳培养箱，日本SANYO公司；Odyssey红外激光成像系统，美国LICOR公司。
1.3 细胞培养细胞用含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素和100 μmol·L-1链霉素的RPMI 1640培养基，置于37℃ 5% CO2培养箱中培养，每1~2 d换液1次，待细胞生长到对数生长期时，用0.25%胰酶消化传代。
1.4 CCK-8法检测细胞存活取对数生长期的细胞用胰酶消化，制成细胞悬液，调整细胞密度为3×107·L-1，以每孔100 μL接种于96孔培养板中，每组设置4个复孔，每孔细胞数3 000。将培养板在37℃、5% CO2条件下培养24 h。加入等比稀释的药物，使其终浓度为：1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1，并设置空白组和DMSO对照组(加入培养液和同等稀释度的DMSO)。药物作用一段时间后，向每孔加入10 μL的CCK-8，置37℃、5% CO2继续培养1~4 h，用酶标仪测定在波长450 nm的光密度(OD)值，并根据(OD)值绘制细胞生长曲线。细胞活力/%=[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100%，抑制率/%=1-细胞活力(%)，每个浓度设4个复孔，实验重复3次。
1.5 siRNA转染M3受体特异性siRNA、阴性对照siRNA由上海吉玛基因公司设计并合成。序列分别为：5′-CGAGCCAAACGAACAACAATT-3′和5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。转染前1 d将细胞接种于6孔板中, 每孔细胞数2×105个，待细胞贴壁，24 h进行转染。实验分3组：以靶向M3受体的siRNA转染H1299细胞为siRNA干扰组、以转染阴性siRNA的H1299细胞为阴性对照组，空白对照组不作处理。按照脂质体LipofectamineTM 3000试剂说明书，按每孔siRNA 200 nmol·L-1、脂质体7.5 μL，分别将siRNA和脂质体加入100 μL Opti-MEMⅠ培养基中混匀，然后将两液混合，室温放置10~15 min，然后将混悬液逐滴加入培养板，轻轻混匀，置于培养箱。转染后4~6 h更换新鲜培养液。转染的H1299细胞，其中一部分72 h后Western blot检测转染效率，另一部分24 h后将细胞消化接种到96孔板继续培养，48、72 h后CCK-8法检测细胞存活。
1.6 细胞内钙成像取1支50 μg的Fluo-4, AM溶于45.6 μL DMSO中，使其终浓度为1 mmol·L-1。取45.6 μL的母液溶于22.8 mL HBSS中，配制成2 μmol·L-1的工作液。H1299细胞接种于激光共聚焦小皿中，培养24 h后弃掉激光共聚焦小皿中的细胞培养液，HBSS溶液洗涤细胞3次后，每皿加入2 mL Fluo-4, AM工作液，37℃、5% CO2孵箱中避光负载30 min。弃去Fluo-4, AM工作液，每皿用HBSS溶液洗涤细胞3次，分别加入不同浓度的拮抗剂孵育30 min。用激光共聚焦显微镜检测细胞，激发波长494 nm，发射波长516 nm，镜下选择合适的细胞后，加入卡巴胆碱刺激细胞，检测钙的动态变化。
1.7 划痕实验检测细胞迁移力取对数生长期H1299细胞，消化接种于背面画有5条横线的6孔板，孵育24 h后，用20 μL枪头在6孔板底垂直于横线划痕，PBS冲洗3次，分别加入低血清培养基稀释的药物，加药后0、24 h于倒置显微镜下观察划痕伤口愈合情况并拍照分析。迁移率/%=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/ 0 h划痕宽度×100%。
1.8 Transwell细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力50 mg·L-1 Matrigel胶稀释8倍包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。每个小室加入50 μL含1% BSA的无血清培养液水化基底膜，37℃、30 min使Matrigel聚合成凝胶。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1~2遍，重悬细胞，调整细胞密度至2×108·L-1。取细胞悬液100~200 μL加入Transwell小室，24孔板下室加入500 μL含10% FBS的培养基。每孔分别加入0、20、40 μmol·L-1 R2-8018，给药处理24 h。弃去小室内培养液，用棉签轻轻擦去基质胶和上室内的细胞，晾干后，每孔用1 mL 0.1%结晶紫染色10 min。显微镜下拍照观察。
1.9 Western blot检测蛋白表达细胞给药处理后，收集并裂解细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。蛋白变性后取等量(50 μg)上样于10%的SDS-PAGE，将电泳分离开的蛋白转印至硝酸纤维素NC膜，5% BSA封闭1 h，加入相关蛋白的一抗，4℃摇床孵育过夜。次日TBST洗膜3次，加入相应种属二抗孵育1 h，再用TBST洗膜3次后，红外荧光扫描成像，用Odyssey软件对条带进行分析，以目的蛋白/actin条带的灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量，实验重复3次。
1.10 统计学分析实验数据以x±s表示，应用GraphPad Prism 5软件作图并进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。
2 结果 2.1 R2-8018与达非那新抑制H1299细胞和H460细胞的增殖CCK-8法48 h检测结果显示(Fig 1)，R2-8018和达非那新对H1299和H460细胞的增殖具有抑制作用，并且随M3R拮抗剂浓度的增大，抑制作用也增加，呈剂量依赖性，其中R2-8018抑制H1299细胞的效果最明显，作用48 h的IC50值为10.6 μmol·L-1。
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| Fig 1 Effect of M3R antagonists on proliferation of H1299(A) and H460(B) cells (x±s, n=4) Cells were treated with R2-8018 or darifenacin for 48 h. Cells treated with 0.1% DMSO were used as a control, with viability set at 100%. |
利用脂质体法转染200 nmol·L-1 M3R siRNA, 72 h后Western blot检测敲减效率，Fig 2结果显示，与空白对照组及阴性siRNA组相比，转染siRNA能够有效敲减M3R；CCK-8法48、72 h检测结果显示，与空白对照组及阴性siRNA组相比，M3R siRNA干扰组H1299细胞增殖明显被抑制，并且随siRNA作用时间延长，抑制作用更明显。
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| Fig 2 Effect of M3 siRNA transfection on proliferation of H1299 cells (x±s, n=6) A:Down-regulation of M3 was detected by Western blot 72 h after transfection of 200 nmol·L-1 M3 siRNA; B: Cells were incubated in the presence of 200 nmol·L-1 siRNA for 48 h and 72 h, after that, cell growth viability was determined using the CCK-8 assay.*P < 0.05, **P < 0.01 vs negative control group. |
激光共聚焦显微镜实时监测钙离子的变化，Fig 3结果显示，30 μmol·L-1的卡巴胆碱能够引起H1299细胞钙信号增强，而拮抗剂达非那新预先处理的H1299细胞，加入30 μmol·L-1卡巴胆碱后细胞内钙信号基本无变化，表明达非那新能够拮抗激动剂卡巴胆碱引起的细胞钙信号增强，说明钙内流可能是M3R的主要信号转导效应。
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| Fig 3 Calcium responses to cholinergic agonists and antagonists in H1299 cells A:Carbachol caused an increase in [Ca2+]i in H1299 cells; B: Darifenacin blocked the carbachol-induced increase in [Ca2+]i, the cells were exposed to 20 μmol·L-1 darifenacin for 30 min, followed by 30 μmol·L-1 carbachol. C: Representative trace of the [Ca2+]i response of H1299 cells to carbachol (30 μmol·L-1) in the presence or absence of darifenacin. This experiment is representative of four others. |
CCK-8法24 h检测结果显示(Fig 4)，0.062 5~2 μmol·L-1星形孢菌素体外对H1299细胞的增殖具有抑制作用，并且随拮抗剂浓度的增大，抑制作用也增加，呈剂量依赖性。
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| Fig 4 Effect of staurosporine on proliferation of H1299 cells (x±s, n=4) Cells were treated with staurosporine for 24 h. Cells treated with 0.1% DMSO were used as a control, with viability set at 100%. |
Western blot检测结果显示(Fig 5)，与对照组相比，5~20 μmol·L-1 R2-8018给药处理24 h，PKC-α蛋白表达水平明显降低。
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| Fig 5 Effect of R2-8018 on PKC-α expression of H1299 cells (x±s, n=3) Cells were treated with R2-8018 for 24 h. **P < 0.01 vs control group. |
给予H1299细胞和H460细胞20 μmol·L-1达非那新，观察其对调控细胞周期G1检查点上游蛋白分子的影响。Western blot结果显示(Fig 6)，达非那新可时间依赖性下调Ser473p-Akt、Ser9p-GSK3β和cyclinD1的表达，提示拮抗M3R抑制细胞增殖可能是通过抑制Akt/GSK-3β信号通路，下调cyclinD1来实现的。
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| Fig 6 6 Time effect of 20 μmol·L-1 darifenacin on levels of G1 checkpoint upstream regulatory proteins of H1299(A) and H460(B) cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group |
Western blot结果显示(Fig 7)，与对照组相比，20 μmol·L-1 R2-8018处理H1299细胞24 h后，p21蛋白表达水平明显升高。
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| Fig 7 Effect of R2-8018 on p21 expression of H1299 cells (x±s, n=3) Cells were treated with R2-8018 for 24 h. **P < 0.01 vs control group. |
Fig 8划痕实验结果显示，与对照组相比，随着R2-8018浓度升高，H1299细胞的迁移能力明显下降。提示20 μmol·L-1 R2-8018对H1299细胞的迁移能力有明显的抑制作用。
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| Fig 8 Migration of H1299 cells after R2-8018 treatment analysed by Wound-healing assay(x±s, n=4) Cells were treated with R2-8018 for 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
如Fig 9所示，R2-8018作用H1299细胞24 h后，与对照组相比，随R2-8018浓度增加，视野范围内附着在小室底膜下室侧的细胞数量逐渐减少，穿膜细胞数明显减少，说明R2-8018明显抑制H1299细胞的侵袭能力。
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| Fig 9 Invasion of H1299 cells after R2-8018 treatment analysed by Transwell invasion assay (x±s, n=4) Cells were treated with R2-8018 for 24 h. *P < 0.05, **P < 0.01 vs control group. |
Fig 10 Western blot结果显示，5~20 μmol·L-1 R2-8018作用H1299细胞24 h后，随着浓度的增加，H1299细胞的MMP-2蛋白表达水平明显降低。
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| Fig 10 Effect of R2-8018 on MMP-2 expression of H1299 cells (x±s, n=4) Cells were treated with R2-8018 for 24 h. **P < 0.01 vs control group. |
目前，早期肺癌以手术治疗为主，而晚期肺癌以化疗为主，然而并不能有效提高患者的5年生存率。近年来靶向药物兴起，虽然酪氨酸酶抑制剂在晚期NSCLC的治疗中取得较好进展，但并非所有的NSCLC患者都能获得生存质量的改善[12]。因此，迫切需要发展新的治疗策略。
实验室前期采用本所自主合成的抗胆碱药R2HBJJ，发现不同组织类型的肿瘤细胞对R2HBJJ具有不同的敏感性，其中以非小细胞肺癌细胞H1299、H460和H157最为敏感，并且H1299细胞对多种N受体拮抗剂不敏感。放射性配体受体结合实验表明，R2HBJJ对M3R选择性强，表明R2HBJJ抑制肿瘤细胞增殖并非细胞毒作用。本实验中，单独应用本所自主合成的M3R拮抗剂R2-8018(R2HBJJ同系物)及市售M3R拮抗剂达非那新，能够抑制H1299和H460细胞的增殖，且具有剂量依赖性。接着采用脂质体介导的siRNA转染技术敲减M3R，首先观察敲减效率，发现siRNA转染72 h后能够有效降低H1299细胞M3蛋白表达，CCK-8法观察siRNA转染48、72 h后对H1299细胞增殖的影响，发现敲减M3R的H1299细胞增殖同样受到抑制，并且对细胞增殖的抑制作用随siRNA作用时间延长而更加明显，这与我们单独应用M3R拮抗剂的结果是一致的。已知M3R与Gq蛋白偶联，激动M3R可激活磷脂酶Cβ(PLCβ)，导致钙内流增加和蛋白激酶C(PKC)激活，进而激活多种与细胞生长过程相关的受体、蛋白、转录因子等。通过细胞内钙成像我们发现，外源性给予H1299细胞卡巴胆碱可引起钙内流增加，此作用可被M3R拮抗剂达非那新完全阻断；CCK-8实验结果证实PKC抑制剂星形孢菌素对H1299细胞增殖具有明显抑制作用，并且M3R拮抗剂剂量依赖性的降低H1299细胞PKC-α蛋白表达水平，说明拮抗M3R可以通过其G蛋白偶联信号发挥细胞生长抑制作用。
PI3K/Akt信号转导通路参与调节细胞生长、增殖、分化、迁移、凋亡以及细胞应激和恶性转化，是人类癌症治疗的关键靶点，而G蛋白偶联受体则是将细胞外信号传递至这些激酶通路的主要介质之一。一旦被激活，PI3K催化PIP2生成PIP3，PIP3结合PDK1，促使Akt磷酸化后激活，Akt作用于下游GSK3β，引起GSK3β磷酸化使其失活，减少对cyclinD1的降解，促进细胞周期进行。我们发现，拮抗M3R能够时间依赖性下调Ser473p-Akt和Ser9p-GSK3β。前期研究表明[13]，M3R拮抗剂诱导H1299细胞凋亡发生率较低，其主要是能够诱导H1299细胞产生G0/G1期阻滞。细胞周期调控异常是恶性肿瘤发生发展中最基础的机制，常伴随周期相关蛋白的异常表达[14]。Western blot显示，20 μmol·L-1达非那新处理H460，cyclinD1蛋白表达下调，20 μmol·L-1 R2-8018处理H1299，p21蛋白表达水平明显升高。通过以上结果我们推测，拮抗M3R抑制细胞增殖可能是通过抑制Akt/GSK3β信号通路，抑制cyclinD1活性，并上调p21来实现的。
肺癌发生侵袭性转移是致使患者最终死亡的首要原因。本研究实验结果表明，M3R拮抗剂R2-8018作用H1299细胞24 h后，能够抑制H1299细胞的迁移和侵袭能力。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一组金属离子高度依赖的蛋白酶，它可通过降解细胞基底膜和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)中各种蛋白成分，从而促进肺癌向周围组织浸润和转移。本研究显示，5~20 μmol·L-1 R2-8018作用H1299细胞24 h后，随着浓度的增加，H1299细胞的MMP-2表达水平明显降低。提示M3R可能通过MMP-2促进H1299细胞的迁移和侵袭。
综上所述，本研究发现，M3R在NSCLC中表达并过度激活，参与介导了NSCLC的生长增殖、侵袭和迁移等，其作用与机制可能是拮抗M3R，通过抑制Akt信号通路的激活而抑制NSCLC细胞的增殖与迁移，其体内抗肿瘤活性有待进一步研究。
( 致谢: 本文实验是在军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理与生化药理实验室完成，感谢张树卓、刘晓燕老师以及张康、王华、兰丽婷、杨蕊等同学的帮助！)
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