乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。据全国肿瘤登记中心预计，2015年中国乳腺癌发病率和死亡率分别占女性癌症发病和死亡的15%和7% [1]，并呈现逐年上升的趋势[2]。临床研究表明，一些天然产物在药理学和癌症治疗中具有潜在的应用，具有直接性和毒性作用小等特点，可直接作用于病变部位，减少了对正常组织和细胞的损害。因此，从天然药物中寻找抗肿瘤的新型药物具有重要意义[3]。北美海篷子(Salicornia bigelovii Torr.)生长于盐碱地、盐湖旁及海边[4]，可直接利用海水灌溉[5]，栽培海蓬子还能吸收与利用海水水产养殖池排污物的营养，构建生态湿地，为野生禽类提供食物和栖息地，有益于改良生态环境[6]。现代药理学研究表明，北美海篷子具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗凝血的作用[7-8]。此外，研究发现，从北美海篷子分离得到多种皂类成分，都具有很好的抗肿瘤作用[9]。bigelovii E是从北美海篷子中分离得到的一种三萜类化合物，结构见Fig 1 [10]。本课题组研究发现，bigelovii E对乳腺癌细胞MCF-7具有明显的体外抑制作用，且对正常细胞的毒性较低，但其作用机制尚不明确。因此，本研究进一步观察了bigelovii E对MCF-7细胞凋亡的影响，分析bigelovii E对MCF-7细胞线粒体凋亡通路的调控及其作用机制。
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| Fig 1 Chemical structure of bigelovii E |
人类癌细胞系(MCF-7、Hela、HepG2、A549、B16、Lovo、LN229)和正常细胞株(HLF-1)均购自中国科学院上海细胞库。
1.1.2 试剂Bigelovii E由本课题组从北美海篷子中分离纯化获得；胰蛋白酶和DMEM培养基购自以色列BioInd公司；胎牛血清(FBS)购自北京索莱宝科技有限公司；MTT、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、Hoechst 33258、罗丹明123、DCFDA、NAC均购自美国Sigma Aldrich公司；Annexin V-PE/7-ADD细胞凋亡试剂盒，购自美国BD公司；BCA蛋白测定试剂盒、RIPA裂解缓冲液，购自江苏碧云天生物技术研究所；一抗PARP、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-7、Mcl-1、Bax、Bak、Bcl-xl、mTOR、p-mTOR、p-p70S6K、p-4-EBP、β-actin，Tubulin以及二抗，购自美国CST公司；ECL化学发光液购自美国Thermo Fisher Scientific公司。所有其他化学试剂均购自沈阳国药化学试剂有限公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养细胞在含有10% FBS、青霉素100 kU·L-1、链霉素100 g·L-1的DMEM或RPMI 1640中培养，培养条件为37℃、5% CO2。培养液2~3 d更换1次。
1.2.2 MTT法分别取处于对数生长期的细胞，铺于96孔培养板中，每孔100 μL，含有细胞5 000个，分别用(3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg·L-1)的bigelovii E处理，每个浓度重复3孔，在37℃、含5% CO2的培养箱中孵育。72 h后，向各孔中加10 μL MTT(5 g·L-1)，培养箱中继续孵育4 h后，每孔中加入100 μL DMSO，振摇5 min，用酶标仪在波长570 nm下测定每孔的吸光值，进行至少3次独立实验。通过确定每个细胞系的IC50值，检测bigelovii E对肿瘤细胞和正常细胞活力的影响。
1.2.3 集落克隆实验将细胞以400个细胞/孔的密度接种在6孔板上。24 h后，用bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)或DMSO处理MCF-7细胞。培养液每3 d更换1次。再培养10 d，观察到细胞集落形成后，去除培养液，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定10 min，结晶紫染色后计数。进行至少3次独立实验。
1.2.4 Hoechst 33258荧光染色取处于对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞，常规消化，制成单细胞悬液，计数，以2.5×107·L-1接种于6孔板中，用不同浓度的bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)处理48 h后，细胞用PBS洗涤2次，固定液固定10 min，然后用0.5 mL Hoechst 33258染色5 min，去除培养液，PBS洗2次，在倒置荧光显微镜下分析形态学变化。
1.2.5 Annexin V-PE/7-ADD双染法测定细胞凋亡率取对数生长期细胞，1×105个接种于6孔板，用bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)处理细胞48 h，并用PBS洗涤。随后收集细胞，并重悬于100 μL结合缓冲液中。将细胞悬浮液与Annexin V-PE和7-ADD染液在黑暗中孵育15 min，加入400 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测，采用Accuri C6 software获取并分析数据。
1.2.6 检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)将MCF-7细胞(1×105/孔)接种到6孔板，用bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)处理。48 h后弃去培养基，用PBS清洗3次，然后在含有10 μmol·L-1 RH123探针的无血清DMEM培养基中37℃孵育30 min。细胞用PBS洗涤3次，常规消化，制成单细胞悬液后，用流式细胞仪检测荧光强度。
1.2.7 细胞内活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平的测量将对数生长期细胞(1×105/孔)接种在6孔板中，然后用含有不同药物的培养基处理。收集细胞后，加入10 μmol·L-1 DCFDA，在黑暗中37℃孵育30 min。流式细胞仪测定细胞内ROS含量。
1.2.8 Western blot检测相关蛋白的表达细胞用不同浓度的bigelovii E处理48 h后，收集细胞，提取各实验组细胞总蛋白。等量的蛋白(30 μg)在10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，然后加适当的一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，二抗室温孵育2 h，ECL发光液反应1 min后，显影，定影。
1.3 统计学方法所有实验结果均源自3次独立实验，采用SPSS 22.0版本统计学软件处理。实验数据采用x±s表示，进行独立样本t检验。
2 结果 2.1 Bigelovii E对肿瘤细胞和正常细胞增殖的影响使用MTT法检测bigelovii E对人肿瘤细胞和正常细胞增殖的抑制作用。bigelovii E对人乳腺癌细胞MCF-7、宫颈癌细胞Hela、肺癌细胞HepG-2、肝癌细胞A549、黑素瘤细胞B16、结肠癌细胞Lovo、脑胶质瘤细胞LN229的IC50值分别为8.17、8.67、13.14、10.64、18.35、9.48、34.93 mg·L-1(Fig 2)。其中，bigelovii E对MCF-7细胞株最敏感，并具有剂量依赖效应，同时对人正常细胞株HLF-1的存活率无明显影响(Fig 3)，表明bigelovii E对MCF-7具有较好的选择性。
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| Fig 2 IC50 of bigelovii E on different cancer cells |
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| Fig 3 Inhibitory effects of bigelovii E on proliferation of MCF-7 and HLF-1 cells *P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
集落形成可以体现细胞独立生存能力，常用于抗癌药物敏感实验、肿瘤放射生物学实验。Fig 4结果显示，与对照相比，bigelovii E明显抑制MCF-7的集落形成，且浓度越高效果越明显，显示了剂量依赖效应。
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| Fig 4 The inhibitory effects of bigelovii E on clongenic potential of MCF-7 |
Hoechst 33258染色结果显示(Fig 5)，bigelovii E 2.5、5、10 mg·L-1处理后，随着药物浓度增加，细胞可以观察到更明亮的荧光和典型的凋亡特征，如细胞生长减少、体积缩小、变形为圆形，而对照组呈圆形或椭圆形的正常形态。将bigelovii E按不同终浓度(2.5、5、10 mg·L-1)处理MCF-7细胞48 h后，Annexin V-PE/7-ADD双染结果表明(Fig 6)，与对照组相比，用bigelovii E处理后MCF-7细胞凋亡率明显增加。Bigelovii E以浓度依赖性方式诱导细胞凋亡。
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| Fig 5 Effect of bigelovii E on MCF-7 morphological change (×200) A: Control; B: Bigelovii E 2.5 mg·L-1; C: Bigelovii E 5 mg·L-1; D: Bigelovii E 10 mg·L-1 |
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| Fig 6 Effects of bigelovii E on MCF-7 by Annexin V-PE and 7-ADD double staining A: Control; B: Bigelovii E 2.5 mg·L-1; C: Bigelovii E 5 mg·L-1; D: Bigelovii E 10 mg·L-1 |
Fig 7的Western blot结果表明，不同浓度bigelovii E(2.5、5、10 mg·L-1)处理MCF-7细胞48 h后，活化的PARP、caspase-3、caspase-7、caspase-9表达水平明显增加，进一步证明bigelovii E促进了细胞凋亡。
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| Fig 7 Effects of bigelovii E on expression of apoptosis perform protein in MCF-7 |
为了检测bigelovii E诱导的MCF-7细胞凋亡是否通过线粒体功能介导，通过RH123染色和流式细胞仪分析测定Δψm。Fig 8结果显示，2.5 mg·L-1 bigelovii E处理MCF-7细胞24 h后，线粒体膜电位出现明显降低。随着作用浓度升高至5、10 mg·L-1，流式细胞仪检测到更明显的去极化峰。这一结果证明，bigelovii E作用细胞后，引起线粒体膜电位下降，导致线粒体功能紊乱，进而激发线粒体凋亡，诱导细胞凋亡。
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| Fig 8 Effects of bigelovii E on integrity of mitochondrial membrane in MCF-7 A: Control; B: Bigelovii E 2.5 mg·L-1; C: Bigelovii E 5 mg·L-1; D: Bigelovii E 10 mg·L-1 |
ROS不平衡可能促进线粒体功能障碍，并引发线粒体介导的细胞凋亡。Fig 9结果表明，与对照相比，bigelovii E作用后，细胞内ROS水平增加，而这种增加效应在加入ROS阻断剂NAC后有所回落。说明bigelovii E可引发细胞内ROS水平增加，使线粒体功能受损。
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| Fig 9 Effects of bigelovii E on intracellular ROS in MCF-7 |
通过Western blot进一步检测了bigelovii E对Bcl-2家族的影响，发现抗凋亡蛋白Bcl-xL和Mcl-1表达明显降低，而促细胞凋亡蛋白Bax表达明显增加(Fig 10)。说明bigelovii E可通过调控线粒体凋亡通路相关蛋白，诱导MCF-7细胞凋亡。
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| Fig 10 Effects of bigelovii E on expression of Bcl-2 protein family in MCF-7 |
Fig 11的Western blot结果表明，mTOR及其下游靶点p70S6K和4-EBP磷酸化水平均明显降低，但mTOR蛋白总量并未发生明显变化。因此推测bigelovii E可通过调控mTOR的磷酸化位点，抑制mTOR活化，进而降低其下游靶点p70S6K和4-EBP磷酸化水平，激活线粒体凋亡通路，最终诱导细胞凋亡。
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| Fig 11 Effects of bigelovii E on expression of mTOR signaling pathway in MCF-7 |
目前，乳腺癌已成为世界范围内的严重公共卫生问题。我国虽是乳腺癌低发国家，但其发病率呈上升趋势[3]。因此，为了减缓这一趋势，从天然药物中寻找新型有效的抗乳腺癌药物具有重要意义。我们课题组研究发现，bigelovii E作用于MCF-7细胞，可调控线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡，具有良好的抗肿瘤效果。
我们的研究认为mTOR是bigelovii E抑制MCF-7细胞增殖的重要靶点。mTOR信号通路参与细胞凋亡过程，在多种疾病中发挥重要作用[11-12]。Yu等[13]实验证明，mTOR/p70S6K通路通过调控caspase级联体系和Bcl-2家族中抗凋亡因子的表达，在细胞凋亡的线粒体损伤途径中发挥作用。本研究发现，经bigelovii E处理后的MCF-7细胞中，p-mTOR、p-p70S6K和p-4-EBP的表达量与对照组相比均明显减少，并且具有浓度依赖效应，表明mTOR/p70S6K信号转导通路在bigelovii E诱导MCF-7细胞凋亡作用中具有重要地位。因此，推测bigelovii E可由mTOR介导的线粒体凋亡途径，提高细胞凋亡执行蛋白的活化水平，促使细胞凋亡。
随着线粒体调控细胞凋亡的发现，线粒体诱导肿瘤细胞凋亡成为目前研究的热点[14-15]。线粒体是多种促细胞凋亡信号转导分子的靶点，同时也是细胞死亡通路的整合元件，细胞凋亡过程中许多重要事件的发生都与线粒体密切相关。流式细胞术检测表明，bigelovii E作用细胞后，可明显降低线粒体膜电位，增大膜通透性，促使ROS释放，进而影响线粒体功能。同时，Western blot实验表明，bigelovii E处理后的MCF-7细胞抗凋亡蛋白Bcl-xl、Mcl-1的表达与对照组相比明显减少，而促凋亡蛋白Bax的表达明显增加，且浓度依赖效应明显。因此，推断bigelovii E可通过上调Bax表达，下调Mcl-1、Bcl-xl，激发ROS释放、降低线粒体膜电位，进而导致线粒体功能紊乱，诱导MCF-7细胞凋亡。
本实验初步研究表明，bigelovii E对人乳腺癌MCF-7细胞有明显的抗肿瘤活性，可激活mTOR介导的线粒体凋亡通路，进而诱导MCF-7细胞凋亡。但其作用途径尚有待深入研究，以更全面、系统地阐明bigelovii E对MCF-7增殖抑制的分子机制。
( 致谢: 本研究是在江苏省中国科院植物研究所完成，衷心感谢各位老师和同学在实验过程中的帮助与指导。)
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