同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种含巯基氨基酸，是甲硫氨酸去甲基化过程中的产物，可通过多种途径促发炎症反应，启动由细胞免疫所介导的局部和全身慢性炎症。研究发现^[1]，Hcy可激活核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)，导致多种炎症基因转录，参与炎症的发生。炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，发病机制目前尚未完全明确。研究发现，IBD患者肠黏膜中，经由5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)代谢合成白三烯(leukotrienes，LTs)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2) 代谢合成前列腺素(prostaglandins，PGs)的量升高。肠黏膜发生炎症时，由COX-2合成的PGE₂引发血管扩张、黏膜充血水肿及渗透性增加。5-LOX可以调节炎症细胞的迁移浸润，促进炎症介质产生，增加肠黏膜通透性^[2]。在对关节炎大鼠模型研究中发现，抗关节炎药物通过抑制NF-κB信号通路，下调5-LOX和COX-2基因表达，导致LTB4和PGE₂合成减少，减轻关节炎症^[3]，提示5-LOX和COX-2受到NF-κB的调控。另外，我们发现IBD患者结肠黏膜中Hcy浓度明显升高^[4]，且Hcy会进一步加重结肠炎症的病理损伤，但Hcy对IBD肠黏膜炎症损伤的具体机制尚不明确。因此，本研究拟建立高Hcy特征的实验性结肠炎大鼠模型，探讨Hcy是否通过促进NF-κB的表达，调控5-LOX、COX-2合成LTs和PGE₂水平增加，加重结肠炎症。

1 材料 1.1 实验动物与试剂

SD大鼠，SPF级，♂，体质量(200±20) g，实验动物许可证号：34000200000480，由安徽省实验动物中心提供。三硝基苯磺酸(TNBS)、DL-Hcy均购于美国Sigma公司；LTs及PGE₂试剂盒购于武汉新启迪生物科技公司。

1.2 方法 1.2.1 实验分组

大鼠分为4组，每组8只，在室温、光周期12 h : 12 h条件下适应性饲养1周后使用。A组(正常对照组)：生理盐水灌肠+生理盐水皮下注射；B组(TNBS模型组)：TNBS/乙醇溶液灌肠+生理盐水皮下注射；C组(正常对照+Hcy注射组)：生理盐水灌肠+Hcy皮下注射；D组(TNBS模型+Hcy注射组)：TNBS/乙醇溶液灌肠+Hcy皮下注射。

1.2.2 高Hcy血症模型的制备和给药方法

参照文献^[5]，采用10%水合氯醛进行腹腔注射，经肛门将橡胶管插入大鼠结肠内，长度约8 cm，注入(1 : 1) 乙醇溶解的TNBS(100 mg·kg^-1)溶液。对照组灌肠等体积生理盐水。DL-Hcy溶解于生理盐水，滴定pH至7.4，参照文献剂量^[6]，自TNBS模型制备后d 1起，皮下注射Hcy(0.03 μmol·kg^-1)，每天2次，间隔8 h，连续30 d。对照组皮下注射等体积生理盐水。

1.2.3 标本采集

10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切取远端结肠8 cm左右，沿纵轴剪开肠管，冰生理盐水冲洗干净后，取部分结肠进行检测。

1.2.4 ELISA法检测大鼠结肠匀浆LTs(LTB₄、LTC₄、LTD₄、LTE₄)及PGE₂水平

取病变结肠组织，制备成匀浆，采用ELISA双抗夹心法检测其中LTs(LTB₄、LTC₄、LTD₄、LTE₄)、PGE₂的水平。

1.2.5 RT-qPCR法检测结肠黏膜组织5-LOX、COX-2及NF-κB mRNA表达

提取结肠黏膜组织mRNA，取出基因组DNA，合成cDNA后，按照试剂盒说明书进行加样：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s退火，72℃延伸，40个循环。分析方法：relative quantification study，分析指标为：2^-ΔΔCt。5-LOX引物序列：Forward primer: 5′-AGTTGCCTAAGAAGCTCCCA-3′；Reverse primer：5′-GCATCAATGCCATCCAGTAG -3′；产物长度：133 bp。COX-2引物序列：Forward primer：5′-AATCGCTGTACAAGCAGTGG-3′；Reverse primer：5′-GCAGCCATTTCTTTCTCTCC-3′；产物长度：144 bp。NF-κB引物序列：Forward primer：5′-GCCTCATCCACATGAACTTG-3′；Reverse primer：5′-CGCTTCTTCACACACTGGAT-3′；产物长度：120 bp。

1.2.6 统计学方法

使用SPSS 16.0软件进行统计学分析，所有计量数据结果采用x±s表示；组间差异比较单因素方差分析，组内差异采用LSD检验，方差不齐采用Dunnett-t检验。

2 结果 2.1 Hcy对结肠炎大鼠结肠匀浆中LTs和PGE₂水平的影响

如Tab 1所示，与正常对照组比较，TNBS模型组及正常对照组+Hcy注射组大鼠结肠匀浆中LTs(LTB₄、LTC₄、LTD₄、LTE₄)及PGE₂水平升高(P＜0.05)。与TNBS模型组比较，TNBS模型+Hcy注射组大鼠结肠匀浆中LTs(LTB₄、LTC₄、LTD₄、LTE₄)及PGE₂水平明显升高(P＜0.05)，提示Hcy引起肠道炎症介质水平的升高。

2.2 Hcy对结肠炎大鼠结肠黏膜中5-LOX、COX-2及NF-κB mRNA表达的影响

如Tab 2所示，与正常对照组相比，TNBS模型组大鼠结肠黏膜组织5-LOX、COX-2、NF-κB mRNA的表达增加。与TNBS模型组相比，TNBS模型+Hcy注射组大鼠结肠黏膜组织5-LOX、COX-2、NF-κB mRNA的表达明显增加(P＜0.05)，提示Hcy可能通过调控NF-κB信号通路，促进5-LOX、COX-2的表达，加重肠道炎症的发生。

3 讨论

本研究通过制备大鼠高Hcy血症实验性结肠炎模型，发现与正常对照组比较，Hcy注射组和TNBS模型组两组大鼠结肠匀浆中的LTs和PGE₂的水平均升高，大鼠结肠黏膜组织5-LOX、COX-2、NF-κB的mRNA表达升高，提示Hcy可能通过对COX-2、5-LOX、NF-κB mRNA表达的调节，引起LTs和PGE₂的升高，促进肠道炎症损伤。因此，通过降低IBD患者体内Hcy水平，有助于减轻炎症损伤，但是Hcy调节COX-2、5-LOX及NF-κB途径的具体机制目前尚不明确，有待进一步的研究。