2. 江苏省中医药防治肿瘤协同创新中心, 江苏 南京 210023
2. Jiangsu Collaborative Innovation Center of Traditional Chinese Medicine Prevention and Treatment of Tumor, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
杂乱而无功能特性的血管生成是肿瘤生长的明显特征之一，肿瘤细胞通过新生的血管获得足够的氧气和营养，以满足其生长、增殖和转移的需要。血管生成抑制剂通过阻断肿瘤血管新生，达到“饿死”肿瘤的治疗效果。目前开发的抗血管生成药物主要作用于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)。一些药物已经投入临床，并与化疗药物联用于肿瘤的治疗。然而，临床中血管生成抑制剂的疗效短暂，不良反应较多，仅适用于少数肿瘤类型，长期用药后甚至促进肿瘤的侵袭与转移[1]。
血管生成抑制剂的缺陷让我们重新认识血管生成，束缚着我们对药物的进一步研发。如何解决上市药物存在的临床问题？如何找到血管生成抑制剂的出口和突破点？抗血管生成疗法的未来又该走向何处？因此，本文综述了近年来的文献研究，系统分析血管生成抑制剂无效的原因和机制，重点在于提出相应的解决策略，为血管生成抑制剂的后续研究提供指引。
1 血管生成抑制剂治疗“失效”的原因 1.1 肿瘤细胞对治疗产生耐药最初研究者认为，抗血管生成疗法是作用于稳定的血管内皮细胞而不是肿瘤细胞本身，所以不会产生耐药。但研究表明，血管生成抑制剂确实存在耐药的情况[2-3]。
肿瘤微环境本身为缺氧状态，迫使肿瘤周围血管再生以提供足够的氧气，维持肿瘤细胞生长。但血管生成被抑制后，肿瘤微环境中缺氧加剧，缺氧状态激活缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)的高表达，继而直接上调其他类型的促血管生成因子表达增加，如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)、血管生成素-2(angiopoietin-2，Ang-2)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)等，血管再生被重新激活[4-6]。因此，治疗产生耐药的主要原因是由于缺氧应答引起的代偿性血管再生。
另外，改变血管生成的方式也让肿瘤细胞逃脱治疗有机可乘。Frentzas等[7]发现，Bevacizumab(首次被FDA批准上市的VEGF抑制剂)在治疗肝癌时，肿瘤细胞利用原有的血管继续生长，通过血管劫留途径使抑制血管生成疗法无效。Dunleavey等[8]在一些恶性程度高的肿瘤中观察到血管拟态的存在，即肿瘤细胞自身形成血管内皮细胞样的表型，替代血管内皮细胞构成有规律的血管系统，从而使抗血管生成疗法产生耐药。
1.2 肿瘤干细胞产生与积聚促进肿瘤复发肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)是存在于肿瘤微环境中，并且具有自我分化与增殖能力的干细胞亚群。肿瘤复发与肿瘤干细胞的产生与积累密切相关。多项研究显示，在血管生成抑制剂治疗过程中，存在肿瘤干细胞积聚的现象。Charafe-Jauffret等[9]使用Bevacizumab联合Sunitinib(一种口服小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂)治疗乳腺癌后，患者体内乳腺癌样干细胞亚群聚集，把这些肿瘤干细胞亚群异体移植到小鼠体内，分化产生肿瘤细胞。Folkins等[10]发现，在抗血管生成疗法治疗恶性胶质瘤过程中，也存在肿瘤干细胞积聚的现象。
肿瘤干细胞都能够诱导VEGF的高表达，募集大量的内皮细胞前体，临床上的化疗以及放疗药物都不能杀死肿瘤干细胞，其不易被清除的特点和强大的分化潜能促进了肿瘤的复发。因此认为肿瘤干细胞的产生可能是肿瘤细胞为了抵抗药物作用，实现分化再生的一种手段。
1.3 肿瘤的转移能力增强，加剧病情恶化Paez-Ribes等[11]在RIP1-Tag2小鼠自发肿瘤模型中，发现血管生成抑制剂促进胰腺癌以及胶质母细胞瘤的转移。Ebos等[12]研究表明，抗血管生成药物促进黑色素瘤及乳腺癌细胞的浸润。Uemura等[13]指出，Sunitinib的治疗同样存在着肾细胞癌侵袭能力增强的现象。
而肿瘤的转移能力增强的原因并不明确。Madsen等[14]认为抗血管生成的治疗降低了内皮细胞表达，导致血管结构疏松，血管通透性降低，形成“渗漏”血管。肿瘤细胞更易透过血管周细胞、基膜及内皮细胞，进入血液，随之迁移。另外，缺氧诱导因子也促进了转移。HIF-1能通过促上皮-间质转化，从而增强肝癌、胃癌及甲状腺癌等多种类型肿瘤细胞的侵袭能力[15]。HIF-2α则可以通过促进肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)的产生，从而协助肿瘤细胞进行浸润与转移[16]。肿瘤细胞的转移加剧了肿瘤恶化，使得血管生成抑制剂疗效不佳。
2 潜在的临床治疗策略肿瘤细胞能够通过激活促血管生成因子表达，改变血管生成，促进肿瘤干细胞的积聚，增强肿瘤细胞侵袭、转移能力等形式逃避血管生成抑制剂的治疗。我们总结归纳了这些现象产生的原因，并针对性地提出了潜在的治疗策略(Fig 1)，期望能用于血管生成抑制剂的临床方案设计，突破当前的瓶颈，给血管生成的研究提供新方向。
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| Fig 1 Therapeutic limitations and strategies of angiogenesis inhibitors |
肿瘤周围血管的结构和功能正常化可增加血流灌注，使得化疗药物顺畅地通过血流到达肿瘤部位，杀死肿瘤细胞。当肿瘤血管处于正常的状态时，联合用药的治疗效果明显提高。而如何增强血管生成抑制剂促血管正常的治疗效应？如何解决抗血管生成疗法的耐药问题？我们根据研究总结，提出了以下的治疗方案。
2.1.1 促、抑血管生成因子的共同调控目前，许多药物都是作用于促血管生成因子(TGF、Ang-2、MMP等)从而阻断血管生成，但是血管生成不仅是促血管生成因子的上调，也包括抑血管生成因子的下调。越来越多的研究发现，血管生成的微环境中还存在着抑血管生成因子低表达的现象，而通过表达抑血管生成因子有助于血管趋于正常。例如双特异蛋白磷酸酶家族中的一种抑癌基因—PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)，PTEN可以通过PI3K/Akt信号通路，下调HIF-1、MMP、VEGF等，抑制血管生成，促进了血管内皮的完整性和血管的正常化[17]。PTEN很可能成为治疗靶点，应用于血管生成抑制剂的研发，为抗血管生成的治疗提供新的思路。血管生成素(angiopoietin，Ang)与血管内皮Tie受体酪氨酸激酶共同作用，调节血管状态。Ang-1通过激活Tie2维持内皮稳定，然而，Ang-2抑制Tie2，促进病理性血管生成、血管渗透性和炎症。Park等[18]发现，ABTAA抗体可发挥Ang-1的促血管正常化作用，激活受体Tie，抑制Ang-2的促血管生成功能，促进化疗药物到达肿瘤病灶，起到很好的治疗效果。
因此，我们猜想“血管正常化”的治疗，不仅仅是抑制促血管生成因子，也要研发调节抑血管生成因子的药物，模拟抑血管生成因子的作用，以加强抗血管生成与化疗药物联用的治疗效果。
2.1.2 采用间期性序贯疗法，避免耐药Teule等[19]研究指出，机体产生抗血管生成药物的耐药性是可逆的，而联合血管生成抑制剂与非血管生成抑制剂进行有规律的间隔治疗，可逆转血管生成抑制剂的耐药[20]。于是，我们提出采用抗血管生成药物与非抗血管生成药物进行间期性序贯治疗的方案，一方面可以使得机体对抗血管生成治疗再次敏感，另一方面，正常化的血管降低肿瘤细胞的侵袭与转移能力。
总而言之，这种“间期性序贯疗法”中的非抑制血管生成药物使得肿瘤细胞对抗血管生成治疗再次敏感，避免治疗耐药，促进“血管正常化”，增强抗血管生成药物的作用。特别之处在于这种治疗方式与单纯的药物联用有所不同，“间期性序贯疗法”在药物的选用、治疗的时间以及间期的长短上进行了有序的设计，从而逆转抗血管生成药物产生的耐药性，是一种更为合理化的联合给药方案。
2.2 抑制肿瘤干细胞的产生与聚集肿瘤干细胞具有强大的抗凋亡及自我更新潜能，其DNA修复能力极强，并且大多处于G0期。因此，肿瘤干细胞的产生使得抗血管生成药物治疗不敏感，而且大多数的化疗药物都无法将其根除，甚至会损伤正常干细胞。血管生成抑制剂治疗后，肿瘤干细胞的产生不仅是因为缺氧应答的激活，而且还与Wnt/β-catenin信号通路相关[21]。Wnt/β-catenin信号通路调节肿瘤干细胞的自我更新与增殖能力，在肿瘤干细胞的生长与分化中起着重要的作用。我们基于肿瘤干细胞产生的原因及耐药的机制，提出一些抑制肿瘤干细胞的治疗方式：① 缺氧应答促进干细胞的产生，因此，通过化疗药物抑制缺氧应答信号通路，可有效减少肿瘤干细胞的积聚。② 使用血管生成抑制剂的同时，阻断肿瘤干细胞分化相关的Wnt/β-catenin信号通路，可降低肿瘤的复发率。③ 肿瘤干细胞具有极强的DNA修复力，所以可利用miRNA、siRNA干扰肿瘤干细胞[22]，从根本上杀死肿瘤干细胞。④ 采用溶瘤病毒特异性地靶向导入肿瘤干细胞，通过病毒转染杀死肿瘤干细胞，避免治疗损伤正常干细胞[23]。肿瘤干细胞与患者的生存期息息相关，所以抑制肿瘤干细胞可有效增强血管生成抑制剂在肿瘤治疗中的疗效。
2.3 实现个体化精准治疗肿瘤患者的生理、病理都存在异质性，在抗血管生成治疗过程中，个体化的精准治疗有利于药物的筛选、治疗效果的优化，延长患者的实际存活期。
2.3.1 检测肿瘤特异性的生物标志物生物标志物是指可以通过定量预测的细胞学、生物学、生物化学或者影像学指标。在使用血管生成抑制剂治疗之前检测生物标志物，其一可根据标志物选择药物，其二可筛选出治疗加剧肿瘤迁移的患者，避免不合理给药，降低肿瘤的浸润与转移。
VHL基因的沉默被视为肾细胞癌的生物标志物，应用Sunitinib表现出良好的治疗效果。然而，Chen等[24]却提出，对于HIF-2高表达的患者，Sunitinib治疗呈现明显的耐药性，而PT2399(一种新型HIF-2抑制剂)表现出更好的治疗效果，能明显抑制肾细胞癌的转移情况。由此可见，根据标志物选择治疗药物与治疗方式是改善抗血管生成治疗的必要手段。况且我们还可以利用影像学的检测手段监测相关指标，观察血管生成方式的变化，以设计对应的治疗方案。临床上越来越多的生物标志物、检测手段促进着肿瘤血管生成治疗向个体化、精准化的方向发展。
2.3.2 建立PDX动物模型治疗时间窗是指治疗的最佳时间区间，在此区间内治疗效果最好，可控制肿瘤的进一步转移与恶化。然而，抗血管药物治疗的时间窗是短暂的，并且患者的治疗时间窗也并不相同，其长短与抗血管生成药物、肿瘤类型相关。所以，需要明确“时间窗”来提高血管生成抑制剂的治疗。人源肿瘤细胞异种移植模型(patient-derived xenograft，PDX)是近年提出的一种治疗模型，这个模型真实可靠地模拟了肿瘤发展情况。针对血管生成抑制剂的治疗时间窗狭窄且不定的特点，PDX是较为合理的方式，可用于确立最佳的治疗时间范围。
PDX采用未经体外培养的人源肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠中，构建出与临床病人同等的疾病状态。Bockhorn等[25]将人源的免疫细胞转导到免疫缺陷的小鼠中建立PDX模型，依据该模型可反映出患者的病理状况。那么，在临床治疗中，我们可以将人源的肿瘤细胞接种到小鼠上，同时进行治疗和监测，利用该PDX模型来确定血管生成抑制剂的治疗时间窗。这个模型的建立将更有利于解决临床患者个体差异问题，提高血管生成抑制剂的治疗作用，有效地控制肿瘤转移。
3 展望本文基于血管生成抑制剂在临床应用中存在的问题，提出了相应的方案，拟解决抗血管生成疗法的局限性和耐药性，但这些方案也对抗血管生成的研究提出了更多的要求：① 需要研究如何共同调控促、抑血管生成因子，使两者之间处在平衡的正常生理状态；② 需要筛选出合适的药物与血管生成抑制剂联用，进行间期性序贯治疗，优化给药方案；③ 需要寻求更有效的杀死肿瘤干细胞方法，降低肿瘤复发率；④ 需要构建与肿瘤的相关性的生物标志物数据库，便于临床用药选择；⑤ 需要解决PDX模型制备上的难度以及鼠、人源间的肿瘤差异，提高个体化治疗的精准性。
血管生成抑制剂在肿瘤治疗中产生的问题使得科研工作者对血管生成有了新的认识和见解。血管生成不是简单的血管再生，还存在着血管拟态、血管劫留等其他血管生成方式，也不是仅有促血管生成因子的作用，还存在着其他因子、基因、缺氧以及肿瘤干细胞等多种因素的共同影响。因此，血管生成抑制剂的研究必定是道阻且长的过程，从而促使科研工作者不断地进行反思，完善治疗方案，提高血管生成疗法的临床价值。
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