2. 贵州医科大学药学院;
3. 民族药与中药开发应用 教育部工程研究中心;
4. 国家苗药工程技术研究中心，贵州 贵阳 550004
2. School of Pharmacy, Guizhou Medical University;
3. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM, Ministry of Education;
4. National Engineering Research Center of Miao's Medicines, Guiyang 550004, China
细胞因子(cytokine, CK)是由免疫细胞和非免疫细胞合成分泌的，存在于细胞间的一类具有调节机体免疫功能、介导炎症反应、参与组织修复和提高机体抵抗力的一类高效的功能蛋白质，其能感受外界因素对机体的刺激，并将信息传递给体内，可分为蛋白质、多肽或糖蛋白。大量文献报道，人胃黏膜上皮GES-1细胞受阿司匹林、乙醇、幽门螺杆菌损伤后，也会释放多种能诱导炎症发生的细胞因子，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6) 等[1-3]。同时，研究发现非甾体抗炎药可激活NF-κB通路，参与胃黏膜损伤的发生、发展[4-5]。
铁皮石斛为兰科石斛属植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的干燥茎，为我国传统名贵药材，具有益胃生津、滋阴清热的功效[6]。在铁皮石斛的前期的实验中发现，铁皮石斛多糖(polysaccharides from Dendrobium officinale, DOP)对阿司匹林损伤GES-1细胞具有保护作用[6]。基于此，本实验用DOP预处理GES-1细胞后加阿司匹林诱导损伤，对GES-1细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-6及其mRNA，以及NF-κB通路相关蛋白表达进行研究，为研发铁皮石斛抗胃黏膜损伤的机制研究提供理论基础。
1 材料 1.1 细胞人永生化胃黏膜上皮细胞GES-1，购于上海中科院细胞库，接种于含10%胎牛血清、1% 100 kU·L-1链霉素的DMEM培养液，于37℃、5% CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养，隔天更换培养液，每3 d按1:3比例传代。实验用细胞均为指数生长期细胞。
1.2 药品与试剂阿司匹林(贵州圣都药业有限公司)；铁皮石斛药材(批号：20151109，贵州医科大学生药教研室龙庆德副教授鉴定)；DMEM高糖培养基、胎牛血清(Gibco)；TRIzol总RNA提取试剂(Invitrogen)；TransScriptTMOne-Step RT-PCR SuperMix(大连宝生物有限公司)；TNF-α ELISA试剂盒、IL-6 ELISA试剂盒(欣波盛生物科技有限公司)。
2 方法 2.1 样品制备DOP的制备方法参见文献[6]，经硫酸苯酚法检测糖含量为30%。加DMSO溶解，配制成10g·L-1的母液，临用前用10%胎牛血清的DMEM培养液分别稀释。
2.2 GES-1分组实验共分为5组，每实验组5个复孔。正常对照组，含10%胎牛血清的DMEM培养液，不加阿司匹林和药液；模型阿司匹林对照组，终浓度18.5 mmol·L-1[6]；药物组为浓度为50、100、300 ng·L-1的DOP预处理24 h后，加入阿司匹林，使其浓度为18.5 mmol·L-1混合液，各药物组作用GES-1细胞24 h后，取上清液进行后续实验。
2.3 GES-1分泌TNF-α、IL-6及其mRNA表达水平GES-1细胞按“2.2”方法处理，按照相应试剂盒方法测定TNF-α、IL-6及其mRNA表达量。测定参照NCBI收录TNF-α、IL-6、GAPDH的mRNA的序列，引物设计与合成由重庆贝辉科技有限公司完成。
2.4 GES-1损伤NF-κB通路p-IκBα、IκBα、p65和p-p65蛋白表达水平测定按“2.2”法处理GES-1细胞，采用RIPA裂解缓冲液提取细胞中的蛋白，BCA法测定蛋白含量。用Quantity one凝胶图像分析系统分析，测定NF-κB通路相关蛋白和β-actin的灰度值的比值，反映蛋白p-IκBα、IκBα、p65和p-p65表达水平的影响。
2.5 统计学方法采用SPSS18.1统计软件进行分析。结果用x±s表示。单因素方差分析(One-Way ANOVA)后，用Dunnett′s test分析方法比较组间差异。两组间比较采用t-test检验法。
3 结果 3.1 DOP对GES-1分泌炎症因子TNF-α、IL-6及其mRNA表达水平的影响ELISA结果表明(Tab 1)，阿司匹林刺激GES-1细胞后，释放出大量的TNF-α、IL-6，与空白组比较差异有显著性(P＜0.01)。多糖与阿司匹林共同作用细胞后，与模型组相比，各组的TNF-α、IL-6释放量明显减少，随药物浓度的增高，其含量逐渐降低，中、高剂量效果明显(P＜0.05, P＜0.01)。RT-PCR检测数据显示，阿司匹林刺激后IL-6、TNF-α mRNA表达与对照组比较均有所提高(P＜0.01)，DOP能剂量依赖性地抑制相关mRNA表达(P＜0.01)。
| Group | Concentration/ng·L-1 | IL-6/ng·L-1 | TNF-α/ng·L-1 | TNF-α mRNA | IL-6 mRNA |
| Control | - | 11.14±1.80 | 11.90±0.48 | 1.000±0.060 | 1.000±0.033 |
| Model | - | 41.49±3.3## | 22.02±1.938## | 1.550±0.020## | 1.699±0.166## |
| DOP | 50 | 35.52±3.08* | 19.36±2.74 | 1.346±0.135** | 1.262±0.103** |
| 100 | 28.70±4.4** | 15.32±2.19** | 1.261±0.065** | 1.155±0.093** | |
| 300 | 15.35±3.25** | 13.73±0.85** | 1.169±0.037** | 1.079±0.076** | |
| ##P＜0.01 vs control; *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | |||||
Western blot结果显示(Tab 2)，与空白对照组相比，阿司匹林作用GES-1细胞24 h能明显增加IκBα、p65磷酸化水平，明显下调IκBα、p65的蛋白表达量。与模型组相比，DOP能剂量依赖性降低阿司匹林刺激引起的IκBα、p65磷酸化，上调IκBα、p65的蛋白表达量。
| Group | Concentration/ng·L-1 | p-IκBα/IκBα | p-p65/p65 |
| Control | - | 0.35±0.29 | 0.3±0.48 |
| Model | - | 1.17±0.09## | 1.06±0.11## |
| DOP | 50 | 0.96±0.05* | 0.96±0.05 |
| 100 | 0.68±0.75** | 0.72±0.028** | |
| 300 | 0.64±0.42** | 0.51±0.049** | |
| ##P＜0.01 vs control; *P＜0.05, **P＜0.01 vs model | |||
该研究发现在阿司匹林诱导GES-1损伤模型中，阿司匹林能刺激GES-1细胞分泌TNF-α、IL-6因子并上调相关mRNA的表达，以及使IκBα、p65磷酸化水平明显上升、IκBα、p65的蛋白表达量明显下降。DOP在实验浓度内可下调TNF-α、IL-6的分泌和相关mRNA的表达、降低NF-κB通路中IκBα、p65磷酸化以及增加IκBα、p65的蛋白表达量，从而使GES-1损伤细胞炎症因子释放量及其mRNA表达水平趋于正常细胞，起到抗阿司匹林损伤作用。本实验初步表明DOP抗阿司匹林诱导GES-1损伤与NF-κB信号通路有关。
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