癫痫是由脑组织局部病灶的神经元异常高频放电，并向周围扩散，导致大脑功能短暂失调综合征。癫痫主要临床表现为突然发作，出现短暂运动、感觉、意识和精神异常，并反复发作，发作时常伴有异常脑电图。反复癫痫发作的患者常伴有认知功能障碍。癫痫的发病机制非常复杂，迄今尚未完全阐明。氧化应激损伤、谷氨酸兴奋性毒性、钙超载、神经胶质细胞增生等多种因素都能诱导神经元异常放电，触发癫痫。其中，氧化应激在癫痫发病中起着重要的作用，可影响脑组织神经元的功能，诱导海马神经元的凋亡[1]，且癫痫的持续时间与氧化损伤呈正相关。有研究表明，部分抗癫痫药物可以通过调节氧化应激系统改善癫痫患者的症状。
Nrf2/ARE通路是机体抵抗内、外界氧化和化学等刺激的防御性转导通路[2]，其核心分子包括核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)、抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)和胞质蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Kelch ECH associating protein 1, Keap1)。核转录因子Nrf2属于CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族(cap-‘n’-collar subfamily of basic leucine-zipper, CNC-Bzip)，Nrf2活化还能抑制炎症介质的生成[3]。Keap是与Nrf2的直接结合蛋白[4]。Keap1含有5个主要结构域，分别是氨基末端NTR、BTB、富半胱氨酸插入域IVR、双甘氨酸重复域DGR以及羧基端CTR。其中，IVR和BTB容易进行氧化还原反应，是调控Nrf2所必需的结构。DGR的6个Kelch功能域形成β折叠结构，与Nrf2的Neh2端序列结合[5]。Keap1在体内抑制Nrf2的活性，允许Nrf2从细胞质转位到细胞核并增强ARE的反应。ARE是一个特异的DNA启动子结合序列，能被多种氧化性和亲电性化合物激活，从而启动Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的表达。
左乙拉西坦(levetiracetam, LEV)作为新型广谱的抗癫痫药已广泛应用。有研究表明，突触囊泡蛋白SV2A是抗癫痫药左乙拉西坦的结合位点[6]，其作用机制为阻断突触前神经递质的有效释放[7]，但其确切机制并未完全明确。左乙拉西坦可以扭转锌等负变构调节剂对γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)和甘氨酸门控电流的抑制作用，可以抑制三磷酸肌醇受体(inositol triphosphate receptor, IP3R)和兰尼碱受体(ryanodine receptor, RyR)介导的钙离子释放[8]，还可以减少钾电流，这些都与其抗癫痫作用相关。左乙拉西坦在癫痫等疾病中还有神经保护作用，且能改善颅脑损伤后的认知[9]。
本实验旨在探讨左乙拉西坦抗癫痫的可能机制，明确Nrf2-ARE信号通路在左乙拉西坦抗癫痫中的作用。有研究表明，抗癫痫药苯巴比妥钠对大鼠学习记忆功能有损害[10]，本实验通过水迷宫模型探讨左乙拉西坦对认知功能的影响。
1 材料与方法 1.1 实验动物成年SD大鼠36只，♂，体质量250~300 g，由山东济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK(鲁)20140007。大鼠置于昼夜(12 h/12 h)节律光照条件下，室温(23±1)℃，自由饮水和摄食，所有大鼠实验前静养1周。
1.2 实验分组随机将大鼠分为4组，每组9只。生理盐水对照(Control)组：0.9%生理盐水(normalsaline, NS)+0.9% NS；戊四唑(pentylenetetrazole, PTZ)癫痫模型组：0.9% NS+戊四唑；左乙拉西坦(LEV)对照组：LEV(20 g·L-1)+0.9% NS；左乙拉西坦(LEV)治疗组：LEV(20 g·L-1)+戊四唑。大鼠首先用8号灌胃针进行灌胃，灌胃物质为分组中的前一试剂，剂量均为10 mL·kg-1。灌胃30 min后，以分组中的后一试剂进行腹腔注射，大约于每天上午8:00~10:00进行，剂量均为2 mL·kg-1。以上各组动物平均体质量差异无统计学意义。
1.3 仪器与试剂Morris水迷宫购自上海软隆科技发展有限公司产品。左乙拉西坦片购自优时比制药有限公司；戊四唑购自Aladdin公司；抗Nrf2 (Lot:GR249953-6)、抗HO-1 (Lot:GR96795-23)、抗NQO1抗体(Lot:GR195043-8)，均购自Abcam艾美捷科技有限公司。
1.4 大鼠癫痫模型制备大鼠于每天上午8:00~10:00腹腔注射浓度为15 g·L-1的戊四唑溶液，连续28 d。模型成功与否以其发作时的行为变化为主要依据，按Racine分级，0级：无任何反应；1级：面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等；2级：1级加节律性点头；3级：2级加前肢阵挛；4级：3级加后肢站立；5级：4级加摔倒。达到4~5级的大鼠选用，未达到4级的淘汰[11]。
1.5 Morris水迷宫实验Morris水迷宫为直径125 cm、高50 cm的圆形水池，水深30 cm，水温保持(26.0±1.0)℃。池壁上有象征4个象限的不同标志，在一个象限的正中离池壁33 cm处放一个直径9 cm、高28 cm的黑色平台，平台顶低于水面15 cm。训练期间迷宫外参照物保持不变。Morris水迷宫测试大鼠对水迷宫的学习和记忆能力。定位航行实验：将水池等分为4个象限，目标象限的中央放置一隐匿平台，定位航行实验共历经5 d。实验开始前l d，让大鼠放入水池(不含平台)自由游泳2 min，d 2开始每天分上、下午两个时间段，每个时间段训练4次。每个时间段分别从池壁2个起点将大鼠面向池壁放入水池，记录每次找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)和游泳路径。如大鼠在60 s内找不到平台，由实验者将其引上平台，潜伏期记为60 s，每次间隔4 min让大鼠休息，再行下次实验[12]。
1.6 Western blot行为学测试结束后，10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射对大鼠进行麻醉，后断头，取双侧海马。将取出的海马放入预冷的裂解液中，在冰上使用电动匀浆机进行匀浆，每个样本匀浆4次，每次10 s，间隔10 s冷却，充分裂解后离心。BCA法对裂解后的蛋白浓度进行定量，随后加入5×上样缓冲液(总体积1/4)，放入沸水中煮沸15 min促进蛋白变性。配制10%或者12%的胶进行恒压电泳，电压设置为：浓缩胶70 V，35 min；分离胶110 V，90~120 min。电泳结束后，采用PVDF膜冰上进行恒压转膜，100 V，75 min。转膜后，3% BSA封闭2 h，加入抗Nrf2、HO-1、NQO1 (1:250)、GAPDH(1:2 000) 一抗孵育，4℃过夜。Washing buffer，摇床5 min×3次，加入碱性磷酸酶羊抗兔或羊抗小鼠二抗(1:2 000，Abcam公司，英国)，室温孵育2 h。二抗孵育后，Washing buffer，摇床5min×3次，显色，采用Image J软件进行灰度值分析。
1.7 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以x±s表示。各组之间的比较采用双因素重复测量方差分析(two-way repeated measures ANOVA)，组间两两比较采用SNK(Student-Neuman-Keuls)法检验。
2 结果 2.1 左乙拉西坦对癫痫大鼠认知功能的影响在Morris水迷宫测试中，各组大鼠给药后d 1的逃避潜伏期无明显差别，d 2、3、4、5的潜伏期均开始缩短(Fig 1A)。PTZ模型组总潜伏期相对于正常对照组明显提高(P＜0.01，Fig 1B)，表明大鼠癫痫模型制备成功；而LEV治疗组可以明显逆转此改变，降低大鼠逃避潜伏期(P＜0.05，Fig 1B)，表明应用左乙拉西坦可以改善癫痫大鼠的认知功能。
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| Fig 1 The escape latency of S-D rats in training test A: The change tendency of escape latency in rats during 5 days; B: Changes of total escape latency of rats in 5 days. **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 vs PTZ group |
Fig 2结果显示，与control相比，PTZ致癫痫模型组海马的Nrf2蛋白表达明显降低(P＜0.01)，说明在此模型中Nrf2介导的防御性转导通路减弱；而给予左乙拉西坦治疗后，与control组、PTZ模型组相比，海马Nrf2蛋白表达明显增加(P＜0.01)，表明左乙拉西坦可能通过加强Nrf2通路的表达起到抗癫痫的作用。
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| Fig 2 Expressions of hippocampus Nrf2 in rats **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs PTZ group |
Fig 3结果显示，与control组相比，PTZ致癫痫模型组海马的HO-1蛋白表达明显升高(P＜0.01)；给予左乙拉西坦治疗后，与control组、PTZ模型组相比，海马HO-1蛋白表达水平进一步明显增高(P＜0.01)，表明左乙拉西坦治疗后进一步升高的HO-1可能参与了抗癫痫作用。
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| Fig 3 Expressions of hippocampus HO-1 in rats **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs PTZ group |
Fig 4结果显示，与control组相比，PTZ致癫痫模型组海马水平的NQO1蛋白表达明显升高(P＜0.01)；给予左乙拉西坦治疗后，与control组、PTZ模型组相比，海马NQO1蛋白表达水平进一步明显增高(P＜0.01)，表明左乙拉西坦治疗后进一步升高的NQO1可能参与了抗癫痫作用。
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| Fig 4 Expressions of hippocampus NQO1 in rats **P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs PTZ group |
作为神经科仅次于头疼的第二大常见病，癫痫的预防和治疗已成为医学界的焦点问题，癫痫对大鼠的学习记忆损害机制并未明了。既往的研究发现，反复癫痫发作可以导致海马结构发生病理变化，包括海马神经元的变性坏死、突触间隙异常增宽及突触后膜的密度改变、海马异常苔藓样发芽以及由此导致的突触联系异常，与学习记忆联系紧密的N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA)受体表达分布异常、信号转导通路异常等。
Nrf2/ARE通路是机体抵抗内外界氧化和化学等刺激的防御性转导通路，生理状态下，Nrf2与Keap1相偶联，且Keap1与胞质肌动蛋白结合而被锚定在胞质。Keap1还会促进Nrf2被泛素蛋白酶迅速降解保持低活性。而当Keap1构象变化，通过直接磷酸化或减少降解，竞争性抑制等方式均可激动Nrf2。Nrf2与Keap1解离，半衰期延长，以稳定状态转位进入细胞核。与小Maf蛋白结合形成异二聚体，然后识别ARE上DNA序列(GCTGAGTCA)，并与之结合形成复合物，诱导抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表达。包括血红素氧化酶(hemeoxygenase-1，HO-1)、醌氧化还原酶[quinone oxidoreductase，NAD(P)H]以及其它参与氧化应激反应的基因[13]。HO-1和NADH是该通路编码的重要的抗氧化酶。HO-1、NADH含量升高，提高了细胞的氧化应激及修复功能。由此可见，真正发挥作用的Nrf2是在入核以后，但胞核的Nrf2表达过少，而以往有文献指出，总Nrf2也可以间接反映各组间Nrf2表达变化的差别[14]。所以，我们在本实验中以总Nrf2作为各组间比较的对象，间接反映各组间Nrf2表达的不同。
在癫痫发作时，可以诱导海马组织中Nrf和其编码的基因产物HO-1和NQO1在蛋白和基因水平表达明显增强。LEV作为新型广谱的抗癫痫药已广泛应用，但其抗癫痫机制并未完全明确。有研究表明，LEV对癫痫患者氧化应激系统有作用，但未探明到底通过何种途径影响。上述已知机体可通过上调Nrf2，提高抗氧化水平和降低氧化产物水平，同时，Nrf2-ARE通路对认知功能的影响，提示LEV是否可以通过此通路起到抗癫痫作用，从而对癫痫患者认知障碍有改善作用。
本实验结果表明，与模型组相比，给予LEV的癫痫大鼠潜伏期明显缩短，海马Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达明显增高，提示LEV可能通过上调Nrf2，提高抗氧化水平和降低氧化产物水平。针对在Western blot结果中，在模型组中，Nrf2的表达是减少的，而其下游蛋白HO-1和NQO-1的表达是增多的结果，有研究表明HO-1基因的表达受多条通路的调控，其调控位点包括ABi序列、HSE区域、USF位点、NF-κB位点、E-box部位、STAP3/AP识别位点、Nrf2结构、UTR结构等多个方面[15]，调控HO-1基因表达的上游通路较多，所以我们暂且保留本实验条件下的结果，在后续的实验中将继续探讨。
针对癫痫患者常伴有认知功能障碍，实验中应用的Morris水迷宫是神经生物学研究动物空间学习、记忆功能常用的行为学检测方法，能够较准确地反映实验动物以视觉为基础的空间学习、记忆、定向及定位能力的变化。与对照组相比，模型组潜伏期明显延长，与模型组相比，治疗组潜伏期明显缩短，表明LEV对癫痫大鼠的认知功能也有一定的改善作用。且本实验采用的PTZ点燃癫痫模型，有组织学分析揭示该模型引起的海马CA1区神经元丢失和齿状回苔藓纤维发芽与人类癫痫极其相似。同时，也有研究表明该模型大鼠海马p38蛋白表达减少，而p38作为突触前终末特异性标记物, 用来检测突触的密度和分布, 是神经元功能状态的标示物之一，这说明PTZ点燃癫痫可能引起海马突触前膜突触囊泡数量减少及功能受损、突触活动减弱、神经递质合成与释放减少等一系列变化, 从而导致了认知功能障碍[16]。这为癫痫后认知功能障碍机制的探讨提供了有力证据。但癫痫后认知功能障碍机制复杂, 还需要进一步的探索和研究。
综上所述，左乙拉西坦能改善癫痫大鼠的认知功能，左乙拉西坦可能通过Nrf2-ARE通路使HO-1、NQO1蛋白含量表达增多，起到抗癫痫的作用。
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