2. 南昌大学 第二附属医院江西省分子医学重点实验室，江西 南昌 330006
2. Jiangxi Provincial Key Lab of MolecularMedicine, the Second Affiliated Hospital to Nanchang University, Nanchang 330006, China
近年来，铁过载诱发细胞、组织损伤逐步引起人们的注意。研究发现，铁在体内具有很强的氧化活性，机体铁过载时可导致活性氧(reactive oxygen species, ROS)的产生[1-2]。血管内皮细胞对ROS极为敏感，是铁过载损伤的主要靶细胞之一[3]。血管内皮细胞产生非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)与细胞内ROS生成互为因果，调控内皮细胞功能，与多种血管内皮功能失调性疾病高度相关，是一种心血管疾病危险因子[4]。ADMA在铁过载引起的血管内皮细胞损伤中的作用及其机制尚未见报道。本文选用人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)，以梯度右旋糖酐铁(iron dextran)确认造成铁过载损伤，分别检测HUVECs细胞内ADMA含量、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)表达、二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶Ⅱ(dimethylarginine dimethylaminohydrolaseⅡ, DDAHⅡ)活性等及其相应的细胞线粒体功能；加用ADMA生理性对抗剂L-精氨酸(L-Arg)[5]，探讨铁过载对HUVECs细胞线粒体的损伤作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂右旋糖酐铁(Iron)、右旋糖酐(Dex)、L-Arg：Sigma公司；eNOS、β-actin抗体及相应二抗：Santa Cruz公司；蛋白提取试剂盒：北京普利来公司；胎牛血清、MEM培养基：Gibco BRL公司；ROS检测试剂盒、线粒体分离试剂盒：Sigma-Aldrich公司；线粒体膜电位检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒：BD公司产品；增强化学发光印迹试剂、硝酸纤维素膜：Amersham, UK；MTT、HEPES、PMSF、亮肽素、丙烯酰胺、SDS、亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、EDTA和DTT：Sigma公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 细胞系及培养HUVECs购自中国科学院细胞库。HUVECs细胞培养于含10% FBS的DMEM培养基中，置于37℃ CO2培养箱培养。细胞生长接近融合状态(70%~80%)时，备用。
1.3 实验分组① 正常对照(Ctrl)组：取正常培养HUVECs细胞，常规培养24 h；② Iron组：取正常培养HUVECs细胞，加入终浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.875 μmol·L-1右旋糖酐铁，孵育24 h；③ Dex组：取正常培养HUVECs细胞，加入终浓度分别为30、15、7.5、3.75、1.875 μmol·L-1右旋糖酐，孵育24 h；④ L-Arg组：取正常培养HUVECs细胞，加入终浓度为7.5 μmol ·L-1右旋糖酐铁，以及终浓度为1 mmol ·L-1 L-Arg孵育24 h。
1.4 MTT比色法检测细胞存活率胰酶消化收集细胞，以每孔104个细胞接种96孔培养板。细胞融合达70%~80%后，弃培养基；加入MTT溶液(5 g·L-1溶于PBS)每孔20 μL，37℃孵育4 h；弃上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min。酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定其OD值。细胞存活率/% = (实验组光吸收值/对照组光吸收值) ×100%。
1.5 HPLC法检测细胞培养液ADMA含量[6]实验结束后，取细胞培养液0.5 mL，加5-磺基水杨酸沉淀蛋白，离心10 min后，取上清液上样，激发波长338 nm，发射波长425 nm检测ADMA含量。
1.6 细胞DDAHⅡ活性测定[6]采用间接法检测。冰浴下将细胞裂解液分为2份，分别加入终浓度为500 μmol·L-1 ADMA；一份立即加入30% 5-磺基水杨酸灭活DDAHⅡ；另一份37℃孵育2 h后，再加入30% 5-磺基水杨酸灭活DDAHⅡ。用HPLC法测定2份的ADMA水平，其ADMA差值反映DDAHⅡ活性。
1.7 Western blot法检测细胞eNOS表达实验结束后，按试剂盒方法提取细胞总蛋白；BCA法蛋白定量后行SDS-PAGE电泳(12%分离胶)；湿转PVDF膜、封闭；eNOS抗体(1:500) 或β-actin抗体(1:500) 孵育，4℃过夜。洗膜后以1:2 000二抗孵育1 h后，ECL化学发光法检测。X线片扫描后，用Quantity One图形分析软件分析，以β-actin相应条带的密度标化相应组的eNOS条带密度。
1.8 生化检测实验结束后，各组分别取培养液200 μL，Beckman生化自动分析仪测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性；消化收集且反复冻融破碎细胞，离心后取上清液，按试剂盒说明书测定细胞内一氧化氮(nitric oxide, NO)及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。
1.9 流式细胞术测定细胞内ROS含量[7]实验结束后，4℃预冷PBS洗涤2~3次细胞；加入含0.02%乙二胺四乙酸(elhylene diamine tetraacetic acid, EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，用10 μmol·L-1 DCFH-DA溶液500 μL重悬细胞，37℃孵育30 min；800×g、5 min离心，弃上清，预冷PBS洗涤2~3次细胞，制成108 ·L-1的悬液，立即以488 nm为激发波长，以530 nm为发射波长行流式细胞仪检测，以不加DCFH-DA的1管为阴性对照。
1.10 流式细胞术测定细胞线粒体膜电位[7]实验结束后，4℃预冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PBS)洗涤2~3次细胞；加入含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，用10 μmol·L-1 JC-1溶液200 μL重悬细胞，37℃孵育20 min；800×g、5 min离心，弃上清，预冷PBS洗涤2~3次细胞，制成109 ·L-1的悬液，立即行流式细胞仪检测，分别以488 nm为激发光波长，527 nm和590 nm为发射光波长测绿色和红色荧光强度，以各组红/绿荧光强度的比值反映线粒体膜电位水平。
1.11 线粒体通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)开放测定以线粒体肿胀实验揭示mPTP开放情况[8]。实验结束后，4℃预冷PBS洗涤2~3次细胞；按试剂盒说明书分离、纯化线粒体；线粒体蛋白终浓度为0.5 g·L-1，25℃、pH 7.4；1 min后加入150 μmol·L-1 CaCl2，分光光度仪检测线粒体在520 nm处的吸光度(OD520)在l min内的变化，持续检测20 min。
1.12 细胞凋亡检测[8]采用AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒及流式细胞仪检测。实验结束后，4℃预冷PBS洗涤2~3次细胞；用不含EDTA的胰蛋白酶消化、收集细胞；用预冷PBS洗2次后，用1×Binding buffer重悬细胞，细胞密度约为5×109 ·L-1；分别加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI；重悬后，室温避光孵育15 min，加入500 μL Binding buffer，立即以激发光488 nm、发射光578 nm行流式细胞仪检测，各组阳性细胞百分率用于表示细胞凋亡状况。
1.13 数据处理应用SPSS11.5统计软件行组间方差分析，各实验组数据均以x±s表示。
2 结果 2.1 右旋糖酐铁对HUVECs细胞存活率以及培养液LDH活性的影响MTT结果显示(Fig 1)，经不同浓度右旋糖酐铁处理48 h后，细胞存活率降低、培养液LDH活性增加(P＜0.01)，3.75~30 μmol·L-1区间呈明显的剂量依赖性；而同步进行的、对应浓度的右旋糖酐处理的HUVECs细胞存活率和培养液LDH活性均无改变(P＞0.05)，表明相应剂量的右旋糖酐铁造成的HUVECs细胞损伤，源于Fe2+毒性，与渗透压改变等因素无关。鉴于7.5 μmol·L-1位于右旋糖酐铁处理剂量区间中段，本文后续实验中凡涉及右旋糖酐铁处理的终浓度均为7.5 μmol·L-1。
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| Fig 1 Effects of iron dextran on cell viability (A) and LDH activity(B) of HUVECs (x±s, n=8) **P < 0.01 vs prior dosage |
Western blot结果显示(Fig 2)，与对照组相比，Iron组细胞eNOS蛋白表达明显下调(P＜0.01)；而1 mmol·L-1 L-Arg可明显减弱右旋糖酐铁下调细胞eNOS表达的作用。
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| Fig 2 Iron overload down-regulated eNOS expression in HUVECs(x±s, n=8) **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs Iron |
如Tab 1所示，Iron组细胞DDAHⅡ活性明显降低，MDA含量升高(P＜0.01)，培养液中ADMA含量明显增加(P＜0.01)，NO含量减少(P＜0.01)；而1 mmol ·L-1 L-Arg可明显逆转右旋糖酐铁的相关作用。
| Group | ADMA/μmol·L-1 | NO/μmol·L-1 | DDAHⅡactivity/% | MDA/μmol·L-1 |
| Control | 0.48±0.03 | 80.26±6.85 | 98.03±8.51 | 3.08±0.28 |
| Iron 7.5 μmol·L-1 | 2.31±0.35** | 39.53±5.66** | 47.24±6.08** | 5.82±0.63** |
| L-Arg 1 mmol·L-1 | 1.16±0.21## | 64.08±7.01## | 76.85±8.58## | 3.42±0.42## |
| **P＜0.01 vs Control; ##P＜0.01 vs Iron. | ||||
如Fig 3所示，HUVECs经右旋糖酐铁处理后，ROS生成明显增加(P＜0.01)；而1 mmol ·L-1 L-Arg处理后，细胞ROS生成明显降低(P＜0.01)，提示L-Arg可减轻铁过载引起的ROS爆发。
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| Fig 3 Iron overload induced ROS generation in HUVECs(x±s, n=8) **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs Iron |
如Fig 4所示，HUVECs经右旋糖酐铁处理后，线体粒膜电位明显减小(P＜0.01)；而1 mmol·L-1 L-Arg处理后，线粒体膜电位明显恢复(P＜0.01)，表明L-Arg可稳定线体粒膜电位。
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| Fig 4 Iron overload loss of mitochondria membrane potential in HUVECs(x±s, n=8) **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs Iron |
如Fig 5所示，HUVECs经右旋糖酐铁处理后，其线体粒受到CaCl2刺激后极易肿胀(P＜0.01)，即线体粒的mPTP易于开放；而1 mmol·L-1 L-Arg处理后，线粒体对CaCl2刺激明显耐受(P＜0.01)，表明L-Arg可使mPTP关闭。
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| Fig 5 Iron overload opened mitochondrial permeability transition pores in HUVECs (x±s, n=8) **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs Iron |
如Fig 6所示，HUVECs经右旋糖酐铁处理后，其阳性细胞百分率明显高于对照组(P＜0.01)；与之相比，1 mmol·L-1 L-Arg处理后，细胞凋亡率明显降低(P＜0.01)。
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| Fig 6 Iron overload induced apoptosis in HUVECs(x±s, n=8) **P < 0.01 vs Control; ##P < 0.01 vs Iron |
自然界的铁离子有高铁(Fe3+)与亚铁(Fe2+)之分，研究发现，仅有Fe2+可被机体吸收，服用Fe3+制剂必须还原成Fe2+。铁是一切生物体所必需的微量元素，它参与细胞的增殖和分化，通过催化氧化-还原反应参与电子传递、细胞呼吸、能量代谢、解毒、DNA合成、酶促反应等许多重要生理过程[9]。然而，铁又是一把双刃剑，铁缺乏是全球最常见的公共营养问题——贫血，过量的铁同样也会对机体产生毒性作用，诱导体内生成过多自由基可导致多种疾病[1-2]。Fe2+具有很强的氧化活性，机体一旦摄入过量的铁，就会有铁游离出来，迅速氧化机体内结合不稳的生物分子，并产生大量的自由基如O2-、OH-、H2O2等，攻击、损伤血管内皮细胞等靶细胞，诱发相关疾病的发生、发展[3, 10]。本实验证实，在3.75~30 μmol·L-1剂量区间，右旋糖酐铁处理24 h可造成HUVECs细胞存活率明显下降，培养液中LDH活性明显增加，且呈明显的剂量依赖性，表明过多的铁离子确实会损伤HUVECs细胞。
研究表明[4-6, 11]，L-Arg与ADMA可竞争性抑制eNOS，影响NO生成，调控血管内皮细胞功能以及血管张力。ADMA由内皮细胞产生，被DDAHⅡ降解、失活。DDAHⅡ对细胞内ROS增加极为敏感而使活性降低，使得ADMA堆积。ADMA不仅与L-Arg竞争eNOS，使NO生成减少，影响内皮细胞功能以及血管张力，且可通过“NOS脱偶联”机制，即eNOS不能催化L-Arg的双电子氧化生成NO，反而产生超氧离子(更多ROS生成)，而对DDAHⅡ产生更为强大的抑制，形成恶性循环，最终导致血管内皮细胞功能衰竭。本实验首次发现，7.5 μmol·L-1右旋糖酐铁处理24 h可使HUVECs细胞eNOS表达下调、DDAHⅡ活性降低、MDA含量增加，而培养液中ADMA含量明显增加、NO含量明显减少(由于未能检测p-eNOS变化，难以确认NO含量改变与eNOS表达下调间的因果关系)；而用1 mmol·L-1 L-Arg同步处理后，铁离子的上述作用明显减弱，表明铁过载造成的HUVECs细胞损伤与eNOS有关，也很可能有ADMA/DDAHⅡ的参与。
近年来发现，线粒体不仅控制细胞的能量代谢，而且在维持细胞钙稳态、调节细胞凋亡或坏死等过程中起着决定性作用[12]。某些触发因素使得部分线粒体产生、释放ROS，通过“活性氧引起的活性氧释放”(ROS-induced ROS-release, RIRR)机制，正反馈性诱发周边正常线粒体产生、释放大量的ROS，即导致ROS爆发；引起线粒体膜电位振荡，mPTP的开放，导致外膜破裂及线粒体不可逆损伤；随之基质肿胀，外膜破裂，细胞色素C等凋亡信号分子释放，导致细胞凋亡或死亡[3, 13]。本实验首次发现，7.5 μmol·L-1右旋糖酐铁处理48 h可使HUVECs细胞ROS生成明显增加，线粒体膜电位减小，mPTP的开放，细胞凋亡明显增加；而用1 mmol·L-1 L-Arg同步处理后，铁离子的上述作用明显减弱，表明铁过载成的HUVECs细胞损伤与其线粒体功能衰竭有关。
综上所述，铁过载可引起HUVECs细胞ROS形成，可能在eNOS以及ADMA/NO/ DDAHⅡ参与下，使得ROS恶性生成，进而激活RIRR机制，诱发mPTP过度开放，最终导致内皮细胞功能衰竭。
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