2. 锦州医科大学药理学教研室，辽宁 锦州 121000
2. Dept of Pharmacology, Jinzhou Medical University, Jinzhou Liaoning 121000, China
丘脑底核(subthalamic nucleus，STN)是基底神经节(basal ganglia，Bgl)重要的核团之一，主要调控机体的运动功能及行为。苍白球(globus pallidus，Gpe)和黑质网状部之间的重要中继站就是STN，在调节Bgl神经核团之间的生理功能及病理活动中起关键的整合作用[1-2]。神经内分泌生物活性肽优洛可定(urocortin，UCN)是由下丘脑分泌，具有多种神经及心血管功能[3]。目前的研究表明，UCN在生理及病理情况下可能对中枢神经系统(central nervous system, CNS)具有保护功能[4-5]。在本实验室既往的研究中发现，UCN对Bgl的另一个主要核团——纹状体(striatum, STR)的自发放电有抑制作用[6]，另外，也发现UCN能通过抑制STR的多巴胺(dopamine，DA)神经元功能，同时抑制兴奋性神经递质的兴奋毒性，可能在帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)中发挥治疗作用[7]。但目前，UCN对STN的神经元放电的影响及对STN内神经递质(如兴奋性神经递质GLU及抑制性递质DA)的调节作用未见报道。本实验选用神经电生理中常用且经典的微电泳技术，结合细胞外记录的实验方法，微电泳UCN、促皮质素释放因子2型受体(corticotropin releasing factor 2 receptor，CRF-2R)抑制剂Astressin(AST)，监测两者对STN神经元放电频率及波形影响，同时监测UCN对STN中抑制性DA能、兴奋性GLU能神经传递的改变，以探讨STN内兴奋及抑制性神经递质间的相互平衡及制约作用，及可能的神经通路机制。目前，很多研究已明确STN是导致PD的重要核团[8]。因此，本研究将为临床治疗神经系统常见疾病，如PD的诊断及治疗，提供有效而可靠的药物作用靶点。
1 材料与方法 1.1 实验动物与试剂Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，由锦州医科大学实验动物中心提供，体质量180~220 g，动物合格证号：SCXK(辽) 2007-0009。UCN(10-6 mol·L-1)；Astressin(AST，CRF-2R的受体阻断剂，10-6 mol·L-1)；DA 0.5 mol·L-1；Cropromazine(CPM，为DA受体的阻断剂，1.0 mol·L-1)；GLU(1.0 mol·L-1)；MK-801(NMDA受体的常用阻断剂，1.0 mol·L-1)；PKA及H-89，上述药品及试剂全部购自美国Sigma公司。
1.2 麻醉开颅并对STN定位取40只上述SD大鼠，乌拉坦腹腔注射(1 g·kg-1)全麻，麻醉成功后，将大鼠置于脑立体定位仪，定位STN，常规开颅术开颅。根据Paxions & Watson大鼠脑图谱，确定STN的坐标：中线旁开2.5~3.0 mm，前囟后3.8~4.0 mm，脑表下7.0~8.0 mm。
1.3 微电泳受试药物采用神经电生理学实验方法中的微电泳技术(51-217型微管拉制仪，美国STOELTING公司)及神经元细胞外记录相结合的实验方法。拉制的7管玻璃微电极呈伞装，中心管直径为4~8 μm间，中心电阻在5~12 MΩ作用。含有1%滂胺天蓝的NaCl溶液(3.0 mol·L-1)灌注于中心管内，作为本实验用引导电极；另外6个外周管的电阻均应控制在20~100 MΩ之间，分别灌注下列受试药物，包括UCN、AST、DA、CPM、GLU以及MK-801。
1.4 生物肽UCN对STN神经元放电影响微电极推进器将玻璃微电极接近定位的STN坐标位置，然后缓慢插入STN，DAM80微电极放大器采集STN神经元单位放电，经过滤波后，示波器上显示STN神经元放电波形，Spike2采集系统(英国CED公司)处理神经元输入的生物电信号。在本实验中，监测STN神经元自发放电情况，包括观察STN放电波形、STN神经元传出分布的方式及频率、是否有爆发式放电、放电的基本特征及形式。通过外周管分别微电泳不同的受试药物，包括微电泳不同浓度神经内分泌生物活性肽UCN及CRF-2R阻断剂AST，微电泳为电流40 nA，滞流的阻力电流为10 nA，微电泳时程20 s，记录UCN及CRF-2R阻断剂对STN神经元放电影响。微电泳UCN过程中给予AST，监测UCN及CRF-2R之间的关系。
1.5 生物肽UCN对STN内的DA能、GLU能神经传递的影响6个外周管实验前1 h灌注GLU及NMDA阻断剂MK-801，把GLU微电泳入STN神经元，观察STN内的神经元自发放电的变化，于微电泳GLU的41~60 s，微电泳20 s UCN，于微电泳GLU的81~100 s之间微电泳AST，20 s。监测UCN对STN内GLU能神经传递的影响。同上述方法，把DA及其受体阻断剂CPM微电泳入STN神经元，监测STN神经元放电的变化，于微电泳DA的41~60 s、81~100 s之间，分别微电泳UCN和CRF-2R阻断剂AST各20 s，监测UCN对STN内DA能神经传递的影响。最后，在微电泳CRF-2R阻断剂AST-2B、PKA及其阻断剂H-89，观察UCN对STN中神经元影响的可能信号机制。
1.6 数据统计实验数据经处理器输出后，生成系列密度直方图，自动统计观STN神经元数量，同时计数给药前后STN神经元放电频率、特征及波形等的变化。实验数据以x±s表示。数据分析采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。
2 结果 2.1 STN神经元自发放电情况共定位并成功观察到STN神经元58个，观察受试STN神经元的放电波形及特征。STN神经元放电频率比较缓慢并且规则，大多为单个神经元放电，为单峰，未见双向动作电位(action potential, AP)，未见爆发式多棘放电。STN神经元放电频率一般在0~8 Hz之间。
2.2 神经肽UCN及AST对STN神经元放电影响本部分实验中共观察STN神经元33个。将UCN(10-6 mol·L-1, 20 nA，20 s)微电泳入受试的STN神经元，81.81%(27/33) STN神经元自发放电频率被降低，对18.19%(6/33) STN神经元无明显改变。上述33个被观察的STN神经元的平均放电频率由微电泳前的(3.65±0.27) Hz减少至(2.05±0.33) Hz，给予UCN前、后STN神经元放电频率降低，差异具有显著性(P＜0.01)。此外，选择对UCN产生抑制作用的STN神经元24个，给予AST(10-6 mol·L-1, 20 nA，20 s)，实验中发现79.17%(19/24) STN的放电频率被CRF-2R阻断剂AST明显升高，由(3.45±0.36) Hz升高至(5.55±0.47) Hz(P＜0.01)。选取对UCN产生抑制效应的上述STN神经元中的20个，微电泳UCN(20 nA，40 s)过程中给予AST(20 nA，20 s)，实验中发现UCN的抑制效应被AST拮抗，差异具有显著性(P＜0.01)，可翻转85%(17/20) STN神经元的抑制效应，频率由(2.11±0.34) Hz增加至(5.45±0.53) Hz。见Fig 1。
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| Fig 1 Effect of UCN on STN neuron's spontaneous discharge AST was used during the period of 21th-40th s in UCN. **P < 0.01 vs normal group; ##P < 0.01 vs UCN group. |
在本部分实验中，观察了对DA产生抑制效应的STN神经元共计21个。发现DA(20 nA，20 s)可使正常的STN神经元产生抑制效应，拮抗STN神经元的正常自发放电波形及频率。STN放电频率由(3.45±0.55) Hz降低至(2.17±0.32) Hz，该实验数据差异具有显著性(P＜0.01)。然后，选取上述对DA产生抑制效应的21个STN神经元，于微电泳DA的21~40 s之间，外周管微电泳UCN(20 nA，20 s)，发现71.42%(15/21) STN中的DA神经元的放电频率进一步下降，放电频率由(2.17±0.32) Hz明显减少至(1.45±0.29) Hz，(P＜0.05)。最后，在微电泳DA的61~80 s之间，由外周管同时微电泳AST(20 nA，20 s)，使原本抑制的76.19%(16/21) STN中DA神经元放电频率明显增加，放电频率由(1.65±0.27) Hz增加至(4.52±0.68) Hz，该实验数据差异具有显著性(P＜0.05)。见Fig 2。
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| Fig 2 Effects of UCN on DA-ergic neuron in STN A: UCN affected DA-ergic neuron in STN. UCN and AST were used to observe the effects of UCN on DA; B: The effects and wave of UCN on STN's DA-ergic neurons. **P < 0.01 vs normal group; ##P < 0.01 vs DA group. |
在本部分实验中，观察对GLU产生兴奋效应的STN神经元共计18个。由外周管微电泳GLU(20n A，20 s)，77.78%(14/ 18) STN神经元产生兴奋效应，其自发放电频率明显加快，差异具有显著性(P＜0.01)。然后，选择上述对GLU产生兴奋效应的14个STN神经元，在21~40 s之间由外周管微电泳UCN(20 nA，20 s)，STN中的78.57%(11/14) 的GLU能放电频率明显减少(P＜0.01)，放电频率由(5.67±0.48) Hz减少至(2.93±0.77) Hz。最后，选用对GLU产生兴奋效应的GLU能神经元14个，在微电泳GLU的61~80 s，于外周管微电泳CRF-2R阻断剂AST(20 nA，20 s)，AST可明显增加STN神经元放电频率(P＜0.05)，放电频率由(5.65±0.38) Hz增加至(6.65±0.47) Hz，见Fig 3。
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| Fig 3 Effects of UCN on glu-ergic neuron in STN A: UCN affected GLU-ergic neuron in STN. UCN could inhibit the excited effects of GLU and AST could excited GLU in STN; B: The effects and wave of UCN on STN's GLU-ergic neurons. **P < 0.01 vs normal group; #P < 0.05, ##P < 0.01 vs GLU group. |
通路的影响在本研究中，另选择对PKA产生作用的STN神经元16个，在提前给予PKA通路激动剂后，再给予UCN，UCN可阻断PKA产生的兴奋效应，在21~40 s之间由外周管微电泳UCN(20 nA，20 s)，STN中的75.0%(12/16) 的GLU能放电频率明显减少(P＜0.01)，放电频率由(4.29±0.37) Hz减少至(3.02±0.33) Hz。在微电泳PKA期间，于外周管微电泳H89(20 s)，PKA的兴奋效应消失，而给予UCN，不能继续抑制STN神经的放电，放电频率由微电泳前的(3.06±0.34) Hz变化至(3.03±0.29) Hz。给予CRF-2R阻断剂AST(20 nA，20 s)，AST也不再增加STN神经元放电频率，放电频率变化为(3.07±0.33) Hz(P＞0.05)。见Fig 4。
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| Fig 4 Effects of UCN on PKA in STN A: UCN affected CRF-2R and PKA in STN. During the period of PKA, administrated UCN, PKA and H89; B: The effects and wave of UCN on STN's PKA and CRF-2R. **P < 0.01 vs normal group; ##P < 0.01 vs PKA group. |
本实验结果表明，神经内分泌生物肽UCN可明显降低基底神经节中的STN神经元放电频率及波形，给药过程中未见爆发式放电，提示UCN抑制STN神经元的放电。然而，CRF-2R阻断剂AST明显加快STN神经元的放电频率，给予AST过程中偶见爆发式放电。另外，微电泳UCN期间同时微电泳AST，AST翻转UCN的抑制效应，实验结果进一步提示STN中存在UCN能神经元，并且UCN与CRF-2R结合后触发随后的生物学效应，产生对STN的抑制作用。
本实验中的结果进一步证实，DA能在STN的神经传递中起抑制效应，而由外周管同时微电泳UCN，UCN协同了DA的抑制效应。相反，AST产生兴奋效应，拮抗DA的抑制效应。本实验结果提示，DA能与UCN在STN的神经元中存在交汇现象。DA能与UCN都对STN放电产生抑制效应，进一步提示UCN可能在PD等病理情况下，对STN神经元起保护作用，并且这种保护作用是通过与CRF-2R结合而实现的。
本实验数据证实，GLU能神经投射纤维对STN神经元有明显的兴奋作用，神经生物肽UCN可以拮抗GLU的过度兴奋效应，且同时微电泳AST对GLU兴奋效应具有一定协同作用，提示UCN及GLU能在STN中存在汇聚作用，UCN与STN神经元中CRF-2R结合后，拮抗STN中的GLU能神经元的过度兴奋毒性。本实验室既往研究发现，在PD病理情况下，DA能神经元在Bgl中的黑质(substantia nigra, SN)——STR通路中受损，这就使DA的抑制作用减弱，从而使具有兴奋效应的神经递质，如乙酰胆碱能(acetyl choline，ACH)及GLU能等相对占优势，导致PD的肌张力增强的临床表现[9-10]。本实验的结果表明，UCN可以降低GLU能的神经兴奋性，降低PD等病理状态下GLU过度表达所产生的兴奋毒性，提示UCN可在PD等疾病中发挥神经保护效应及治疗作用。
UCN2与CRF-2R结合后是如何对STN神经元产生抑制效应的呢？UCN2可能在PD中发挥保护作用机制如何呢？在本实验研究的最后一部分对机制进行了初步研究。实验中发现，UCN能抑制PKA所引起的STN神经元的抑制效应，但UCN的抑制作用在给予PKA阻断剂后，该效应被取消，并且给予CRF-2R阻断剂后，也不再发挥作用，该实验结果提示，UCN很可能与CRF-2R结合后，进而通过激活PKA而引起随后的生物学效应，阻断了神经递质的兴奋毒性作用有关。
UCN是CRF肽类家族的一个新型的神经内分泌生物肽，具有抗焦虑、抗糖尿病心肌病变、降血压、扩血管等多种生理及药理作用[11-12]。另外，本实验室既往已经证实，在脑损伤过程中UCN具有神经保护作用，UCN可抑制STR神经元的过度放电，特别是在大鼠吗啡成瘾中减轻大鼠的成瘾性，能明显改善阿片类药物的成瘾及戒断综合症[7, 13-14]，发挥抑制STR神经元过度放电的神经保护作用。但是，UCN是如何发挥其CNS的保护作用的呢？目前，其具体机制尚不明确[14]。在本实验中，证实UCN与CRF-2R结合后，发挥抑制STN自发性放电的效应，可能是UCN发挥神经元的保护作用的初始机制，并进一步证实UCN与CRF-2R结合后触发了PKA信号通路，这其中可能还涉及其他分子生物学机制，目前仍不明确，应在今后的研究中进一步阐述和证实。本实验结果表明，UCN通过与CRF-2R结合，进而通过激活PKA，抑制STN神经元放电活动，协同DA的抑制效应，降低STN神经元中GLU的过度兴奋性，UCN可能在生理及PD病理情况下发挥CNS保护作用。
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