2. 蚌埠医学院 检验诊断学实验中心、安徽 蚌埠 233003;
3. 蚌埠医学院 第一附属医院肿瘤外科,安徽 蚌埠 233003
2. Research Center of Clinical Diagnostics Lab; Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233003, China;
3. Dept of Oncological Surgery; Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233003, China
新藤黄酸(gambogenic acid,GNA)是中药藤黄中的主要成分之一,基础研究表明,GNA可抑制胃癌、肝癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、乳腺癌等多种癌细胞增殖[1-3]。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类长约21~23个核苷酸序列的单链非蛋白编码的RNA分子,在多种肿瘤中可有异常表达,对肿瘤的发生发展具有重要的调节作用。研究表明,miRNA-218(miR-218) 在宫颈癌细胞中表达缺失或低表达,过表达miR-218可诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖,具有抗宫颈癌的作用。本文以宫颈癌HeLa细胞为研究对象,转染miR-218真核表达载体,并联合使用GNA,探讨miR-218对GNA抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖作用的影响及机制,为临床联合应用治疗宫颈癌提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞与试剂人子宫颈腺癌HeLa细胞为本实验室冻存。GNA购自中国上海士锋生物科技有限公司;胎牛血清、RPMI 1640培养基,购自Gibco公司;脂质体LipofectamineTM2000、TRIzol,购自Invitrogen公司;miR-218 Real-time PCR试剂盒,购于上海吉玛制药技术有限公司;MTT试剂,购于Sigma公司;Annexin V/PI凋亡检测试剂盒,购于南京凯基生物科技发展有限公司;BCA蛋白浓度定量检测试剂盒,购于碧云天生物技术研究所;ECL化学发光剂,购自Thermo公司;Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-E-cadherin抗体,购自Santa Cruz公司;逆转录试剂盒和PCR试剂盒,购自Promega公司。
1.2 Real-time PCR检测转染pmiR-218对HeLa细胞miR-218表达的影响实验分组:空白对照组、pmiR-218组和空质粒对照组,每个组设3个复孔。pmiR-218和空质粒的DNA转染浓度为0.05 mg·L-1。将细胞以1.5 ×108·L-1接种于24孔板,按LipofectamineTM2000说明书要求,转染质粒。转染48 h后,离心收集细胞,按TRIzol操作说明书提取各组细胞总RNA。按real-time PCR试剂盒操作说明书要求,检测细胞内miR-218的表达水平。用2-△△Ct方法进行相对定量分析。
1.3 MTT法检测pmiR-218对GNA抑制HeLa细胞增殖作用的影响将HeLa细胞按1×108·L-1接种于96孔板,设4个复孔,按LipofectamineTM2000操作说明书要求,转染质粒。实验分组:空白对照组、空质粒对照组、pmiR-218组。3组细胞分别加入不同浓度的GNA。GNA浓度为0、0.63、1.25、2.50、5.0、10.0 mg·L-1。转染48 h后,进行MTT检测,全自动酶标仪检测553 nm处各孔的光密度(OD)值。增殖抑制率/%=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。药物增敏倍数=单纯用药组的IC50/联合用药组的IC50。
1.4 流式细胞术检测GNA联合pmiR-218对HeLa细胞凋亡的影响实验分组:空白对照组、GNA组、pmiR-218组、空质粒对照组、GNA+pmiR-218组。GNA浓度为2.0 mg·L-1。将HeLa细胞以1.5×108·L-1接种于24孔板,转染方法同前。48 h后,离心收集细胞,用PBS洗涤3次,按Annexin V/PI凋亡检测试剂盒说明书加入试剂,流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.5 Western blot检测GNA联合pmiR-218对HeLa细胞内蛋白表达的影响实验分组及转染方法同前。转染48 h后,裂解细胞提取蛋白,按蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量并校正。取等量蛋白样品加入样品裂解液,置沸水中煮5 min,SDS-PAGE电泳,转膜。TBST洗膜后,5%牛血清白蛋白封闭1 h,加入一抗4℃孵育过夜。TBST脱色,加入二抗,37℃孵育1 h。加入ECL显影,曝光,以β-actin作为内参照,对条带进行灰度分析。
1.6 qRT-PCR检测GNA联合pmiR-218对HeLa细胞相关基因表达的影响实验分组同前。取5组宫颈癌HeLa细胞培养72 h后,收集细胞。按TRIzol操作说明书,提取各组细胞总RNA。按Real-time PCR试剂盒操作说明书要求,检测细胞内Bcl-2、Bax、E-cadherin的mRNA表达水平。用β-actin基因作为内参,2-△△Ct方法进行相对定量分析。
1.7 统计学处理采用SPSS 11.0软件进行统计学分析,所有数据以x±s表示。
2 结果 2.1 HeLa细胞内miR-218的相对表达水平Fig 1的real-time PCR结果显示,HeLa细胞转染pmiR-218后,细胞内miR-218的表达水平相对于对照组和空质粒组均明显增加,转染空质粒组和对照组相比无明显变化。表明HeLa细胞转染pmiR-218后,细胞内miR-218的表达水平明显增高。
2.2 转染pmiR-218,检测GNA对HeLa细胞的增敏作用单独使用GNA,IC50为5.68 mg·L-1,GNA和pmiR-218联合应用IC50为1.94 mg·L-1(P<0.05),增敏倍数为2.93,两者联用为协同作用(Tab 1)。提示,高表达miR-218能够提高HeLa细胞对GNA的药物敏感性。进一步应用2.0 mg·L-1 GNA和pmiR-218联合,用MTT检测对细胞生长的影响。由Tab 2结果可知,单独使用GNA组和单独转染pmiR-218组,对HeLa细胞生长均有抑制作用,与空白对照组和空质粒组相比,差异有显著性(P<0.05)。GNA和pmiR-218联合作用HeLa细胞,增殖抑制作用明显增强,与GNA组和pmiR-218组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。
GNA/mg·L-1 | GNA | pmiR-218 | ||
OD553 nm value | IR/% | OD553 nm value | IR/% | |
0 | 0.756±0.113 | - | 0.588±0.073 | 23.2* |
0.63 | 0.662±0.076 | 12.6 | 0.474±0.068 | 37.3* |
1.25 | 0.576±0.093 | 23.8 | 0.401±0.056 | 47.0* |
2.50 | 0.483±0.087 | 36.1 | 0.331±0.043 | 56.2* |
5.00 | 0.416±0.057 | 45.0 | 0.301±0.046 | 60.2* |
10.00 | 0.324±0.043 | 57.1 | 0.273±0.039 | 63.4* |
*P<0.05 vs 0 mg·L-1 GNA |
Group | OD553 nm value | Inhibition rate/% |
Control | 0.746±0.113 | - |
Plasmid | 0.737±0.096 | 1.2 |
Gambogenic acid | 0.478±0.087 | 31.2* |
pmiR-218 | 0.536±0.093 | 28.1* |
Gambogenic acid+pmiR-218 | 0.324±0.043 | 56.4*#△ |
*P<0.05 vs control; #P<0.05 vs gambogenic acid; △P<0.05 vs pmiR-218 |
5组HeLa细胞培养72 h后,收集各组细胞,流式细胞术检测细胞凋亡。由Fig 2可见,GNA组和转染pmiR-218组细胞凋亡率明显高于对照组,GNA和pmiR-218联合应用组,细胞凋亡率明显高于GNA组和pmiR-218组。
2.5 Western blot检测GNA和pmiR-218联合应用对HeLa细胞蛋白表达的影响如Fig 3所示,单独使用GNA和转染pmiR-218后,宫颈癌HeLa细胞Bcl-2蛋白表达均较对照组降低,而Bax和E-cadherin蛋白表达增加,与对照组相比,差异均具有显著性(P<0.05)。GNA和pmiR-218联合应用后,进一步降低HeLa细胞Bcl-2蛋白表达,上调Bax和E-cadherin蛋白表达,与单独使用GNA和pmiR-218组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。
2.6 qRT-PCR检测GNA联合pmiR-218对HeLa细胞Bcl-2、Bax和E-cadherin基因表达的影响如Fig 4所示,GNA组和转染pmiR-218组宫颈癌HeLa细胞Bcl-2的mRNA水平明显下降,与对照组相比,差异有显著性(P<0.05);GNA和pmiR-218联合应用于宫颈癌HeLa细胞,Bcl-2的表达下降更加明显,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),与GNA组和pmiR-218组相比,差异均有显著性(P<0.05);GNA组和转染pmiR-218组Bax和E-cadherin的mRNA表达水平增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。GNA和pmiR-218联合应用组,Bax和E-cadherin的mRNA表达增加与对照组相比,差异有显著性(P<0.05),与GNA和pmiR-218组相比,差异均具有显著性(P<0.05)。
3 讨论藤黄酸是中药藤黄的主要成分,在细胞增殖、侵袭、多药耐药方面发挥抗肿瘤作用,现作为Ⅰ类新药,进入临床试验阶段。现代研究证实,GNA也为藤黄抗肿瘤作用的主要有效成分,在多种癌细胞系和肝癌小鼠模型中,具有抑制肿瘤生长的作用,且有效治疗剂量及毒副作用明显低于藤黄酸,有望开发成抗肿瘤新药。但GNA作为化疗药物单独使用,其作用有限,且存在一定的毒副作用,而联合用药可能会降低GNA的用量,并减少毒副作用,同时提高其抗肿瘤作用。
近年大量的研究显示,miRNAs在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。miRNAs是一种小分子、非编码的RNA,通过与靶mRNA的3′UTR结合,阻碍mRNA翻译或者诱导mRNA分解,从而实现对基因转录后的调控。miRNA与肿瘤细胞形成、侵袭、转移密切相关,miRNA通过与靶基因RNA碱基配对,引导沉默复合体降解RNA或阻碍其翻译[4]。miRNA在多个组织中的差异表达,使表达图谱分析成为研究的重点,miRNA在肿瘤耐药和上皮间质转化中发挥重要作用[5-6]。将miRNA与化疗药物联合应用,发现miRNA可以通过调控抑癌基因、癌基因或凋亡相关基因的表达,提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐药性[7]。
近年来,关于miR-218在肿瘤中的异常表达的现象备受关注。研究发现,多种恶性肿瘤中存在着miR-218表达下调的现象,如头颈鳞癌[8]、膀胱癌[9]、鼻咽癌[10]等。现研究证实,宫颈癌组织中microRNA表达谱发生明显改变,且其与宫颈癌的发生进展密切相关。研究表明,miR-218表达下调与HPV感染相关,miR-218表达降低与宫颈癌发生发展密切相关[11]。我们的前期研究也证实了miR-218在宫颈癌组织中表达下调,上调miR-218表达,可抑制宫颈癌细胞增殖,促进细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用[12]。
本研究通过将miR-218的真核表达载体(pmiR-218) 转染HeLa细胞,上调宫颈癌细胞中miR-218的表达,与GNA联用后,HeLa细胞对GNA的敏感性提高到单独使用GNA的2.93倍,两者表现为协同抗肿瘤作用。提示两者联合使用较单独使用GNA具有更强的抗宫颈癌效果。
GNA和pmiRNA-218共同作用于宫颈癌细胞,探讨二者联合应用对宫颈癌的抗肿瘤作用。流式细胞仪检测结果显示,单独使用GNA和转染pmiR-218均能诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖。两者联合应用后,细胞凋亡率较单独用药组明显增加,提示GNA转染pmiR-218的协同抗肿瘤作用可能与共同诱导HeLa细胞凋亡相关。
细胞凋亡与多种细胞因子表达异常相关。Bax基因是人体最主要的抗凋亡基因,属于Bcl-2基因家族,编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成异二聚体,对Bcl-2产生阻抑作用。研究发现,Bax/Bcl-2两蛋白之间的比例关系是决定对细胞凋亡抑制作用强弱的关键因素,因此认为,Bax是重要的促细胞凋亡基因之一[13-14]。本研究结果显示,GNA和pmiR-218两者联合应用后,Bax蛋白表达上调,Bcl-2蛋白表达明显下调,较单独用药组相比,差异有显著性。qRT-PCR结果亦显示,两者联合应用能进一步上调Bax基因表达,下调Bcl-2蛋白表达。这些结果均提示,转染pmiR-218联合GNA的协同抗肿瘤作用,可能与共同诱导HeLa细胞凋亡相关。
发现新的抗肿瘤靶点、开发特异性的靶向抗肿瘤药物,并与传统药物联合应用,在当今肿瘤治疗研究中显示出良好的发展前景。本研究将GNA与靶向miRNA技术联合使用,提高HeLa细胞对GNA的敏感性,为靶向基因治疗与传统化疗联合应用抗肿瘤提供了实验依据,为宫颈癌的辅助治疗提供新的思路。
( 致谢: 本实验主要在蚌埠医学院临床检验诊断学中心实验室完成,在此对实验室的各位老师及同学的帮助致以衷心的感谢!)
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