2. 江苏省中药药效与安全性评价重点实验室,江苏 南京 210023
2. Jiangsu Key Lab for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica, Nanjing 210023, China
糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见且最难治的微血管并发症,其特征主要表现为炎症、系膜基质累积以及肾小管间质纤维化[1]。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)在DN的发生发展中起到重要的作用[2-4]。近年来研究发现,AGEs还可加重DN炎性损伤[5-7]。巨噬细胞作为主要的炎性细胞,通过其两种极化表型参与炎症反应及维持内环境稳态:即经典活化的M1型巨噬细胞,具有促进炎症、介导损伤的功能;替代活化的M2型巨噬细胞,具有抑制炎症、促进损伤组织修复和重建的功能[8-9]。越来越多的证据表明,巨噬细胞和肾脏固有细胞共同参与DN的发展[10-16]。肾脏固有细胞分泌单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-Ⅰ)、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule Ⅰ, ICAM-1) 等,使巨噬细胞向M1型极化[9, 16],参与炎症反应,加重糖尿病肾损伤[9-11, 17]。
梓醇是生地黄的主要效应成分,具有较好的抗炎和保护肾脏等药理作用[18]。研究证实,梓醇能减少巨噬细胞募集,抑制炎症反应[19],并可抑制肾皮质转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)和血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)的表达,减少细胞外基质积聚,改善DN[20]。鉴于以上认识,本实验从DN病机出发,建立用AGEs刺激的系膜细胞与巨噬细胞共培养模型,观察和探讨梓醇对巨噬细胞极化的干预作用,为其减轻由巨噬细胞参与的糖尿病肾损伤提供实验依据。
1 材料 1.1 细胞与试剂小鼠肾系膜细胞(mouse mesangial cells, MMCs),购自中国科学院上海细胞库;小鼠巨噬细胞(RAW264.7) 由南京中医药大学药理学实验室惠赠。梓醇(catalpol)标准品(HPLC≥98%),购自成都瑞芬思生物科技有限公司,批号:Z-005-160502;氨基胍(aminoguanidine),Sigma公司进口分装;DMEM/F-12 1 :1(1×)培养液、质量浓度为1.5 g·L-1的胰蛋白酶,美国Gibco公司;胎牛血清,美国Gemini公司;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT),美国Sigma公司;RIPA裂解液,碧云天生物技术研究所;MCP-1 ELISA试剂盒,上海酶联生物科技有限公司,批号:201703;iNOS、TNF-α、COX-2、CD206、Arg-1抗体,英国Abcam公司;CD16/32抗体,美国Affinity公司。
1.2 仪器Synergy HT酶标仪,美国Bio-Tek公司;二氧化碳培养箱,日本SANYO公司;FACS Calibur流式细胞仪,美国BD公司;垂直凝胶电泳仪,美国伯乐公司;凝胶成像系统,美国GE公司;Transwell 3450、3413共培养板,美国Corning公司。
2 方法 2.1 AGEs的制备将0.5 mol·L-1葡萄糖与50 g·L-1的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)充分溶解于磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4),37℃避光孵育4个月,形成AGEs-BSA。与此同时,在平行条件下配制不含葡萄糖的上述BSA溶液,使其形成0-BSA溶液(无糖基化BSA)作为对照。AGEs形成后,用孔径为分子量1万的透析袋于10 mmol·L-1 PBS缓冲液中4℃透析24 h,除去未反应的葡萄糖,后经0.22 μm微孔滤器过滤,除去细菌,经BCA蛋白定量测得浓度为16 g·L-1。
2.2 细胞培养小鼠肾系膜细胞(MMCs)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7) 用含1 g·L-1胎牛血清及0.1 g·L-1青霉素-链霉素溶液的DMEM/F12培养基培养,取对数生长期细胞用于实验。
2.3 ELISA法检测系膜细胞上清液MCP-1的分泌取对数生长期MMCs调整至1×108·L-1,每孔1 mL接种于24孔板内,另取对数生长期RAW264.7以5×107·L-1,每孔0.5 mL接种于0.4 μm的Transwell小室,置于孵育箱中贴壁融合后,24孔板和Transwell小室分别更换为不含FBS的DMEM培养基饥饿培养24 h。将细胞分为模型组、梓醇(终浓度分别为0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)组、氨基胍(终浓度为1 μmol·L-1)组,每组设4个复孔,预孵24孔板内的MMCs 1 h后,用终浓度为100 mg·L-1的AGEs刺激,而空白对照组用100 mg·L-1 BSA代替,最后将Transwell小室移至接种MMCs的24孔板上方共培养。23 h后,提取下层6孔板内MMCs上清液,按ELISA试剂盒操作说明书,检测细胞上清中MCP-1水平。
2.4 流式细胞仪检测巨噬细胞蛋白表达百分率取对数生长期MMCs调整至5×108·L-1,每孔2 mL接种于6孔板内,另取对数生长期RAW264.7以3×108·L-1,每孔1 mL接种于0.4 μm的transwell小室。分组与加药处理同“2.3”项,去除上层小室内培养液,用冰PBS冲洗3次RAW264.7,并吹打混悬于小室中,离心收集细胞,重悬在100 μL 1×Buffer缓冲液中,每管加1 μL一抗,在同型对照管中加入100 μL缓冲液,4℃冰箱中孵育20 min,每管中加2 mL 1×Buffer缓冲液,4℃ 300 r·min-1离心5 min,并弃去上清。用冰PBS冲洗3次,将细胞重悬在100 μL 1×Buffer缓冲液中,加入0.8 μL荧光标记二抗,4℃冰箱中避光孵育20 min。用冰PBS冲洗3次后,移至流式测试管,500 μL缓冲液重悬细胞,上机检测巨噬细胞中表达iNOS、CD206蛋白的百分率。
2.5 Western blot法检测巨噬细胞相关蛋白表达取对数生长期MMCs调整至2×108·L-1,每孔2 mL接种于6孔板内,另取对数生长期RAW264.7以1×108·L-1,每孔1 mL接种于0.4 μm的transwell小室。分组与加药处理同“2.3”项。每组设3个复孔,吸除上层小室内培养液,用冰PBS冲洗RAW264.7并吹打混悬于小室中,离心收集细胞,用RIPA裂解液提取细胞总蛋白,并测定蛋白浓度。蛋白样品加入1/5体积的5×蛋白上样缓冲液,95℃煮5 min,进行SDS-PAGE凝胶电泳,接着转印至PVDF膜上,按约0.1 mL·cm-1量加入0.5 g·L-1封闭液,室温封闭2 h,一抗4℃过夜。次日PBST漂洗3次,加入辣根过氧化酶标记的二抗,室温孵育2 h,ECL显色。利用Image J软件分析各组灰度值,以β-actin为内参,计算iNOS、TNF-α、CD16/32、COX-2、CD206和Arg-1蛋白的变化。
2.6 统计学分析实验结果使用SPSS16.0进行分析,数据以x±s表示。组间比较方差齐性采用F检验。
3 结果 3.1 梓醇对系膜细胞分泌MCP-1的影响与对照组比较,AGEs可明显提高系膜细胞MCP-1的分泌水平(P<0.01);而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度抑制其分泌(P<0.01),且梓醇的抑制程度与浓度相关(Tab 1)。
Group | Concentration /μmol·L-1 | MCP-1 /ng·L-1 |
Control | - | 368.09±21.89 |
Model | - | 654.92±26.71** |
Catalpol | 0.1 | 559.52±15.31## |
1.0 | 514.07±14.38## | |
10.0 | 431.56±15.33## | |
Aminoguanidine | 1.0 | 452.86±23.26## |
**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs model |
双变量流式细胞散点图显示,与对照组(Fig 1A、2A)相比,模型组(100 mg·L-1 AGEs)表达iNOS蛋白的巨噬细胞比例升高(Fig 1B),表达CD206蛋白的巨噬细胞比例降低(Fig 2B);而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)和氨基胍(1 μmol·L-1)则不同程度下调iNOS的表达(Fig 1C~1F),上调CD206的表达(Fig 2C~2F)。
3.3 梓醇对巨噬细胞M1型极化相关蛋白的影响与对照组比较,AGEs可明显上调系膜细胞介导的巨噬细胞iNOS(Fig 3)、CD16/32(Fig 4)、TNF-α(Fig 5)、COX-2(Fig 6)蛋白表达(P<0.05, P<0.01),而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度下调其表达(P<0.05, P<0.01),且梓醇的抑制程度与浓度相关,其中10.0 μmol·L-1的梓醇抑制作用最强(P<0.05, P<0.01)。
3.4 梓醇对巨噬细胞M2型极化相关蛋白表达的影响与对照组比较,AGEs可明显下调系膜细胞介导的巨噬细胞CD206(Fig 7)和Arg-1(Fig 8)蛋白表达(P<0.05);而梓醇(0.1、1.0、10.0 μmol·L-1)、氨基胍(1 μmol·L-1)可不同程度上调其表达(P<0.05),且梓醇对CD206、Arg-1表达的促进作用与浓度相关。
4 讨论DN是一种常见的继发性肾病,巨噬细胞介导的炎症反应是DN发展的关键因素[21]。趋化因子MCP-1是肾脏炎症与肾损伤的主要启动子[22]。研究报道[16],AGEs可作用于肾脏固有细胞上的RAGE受体,促使MCP-1分泌,进而诱导、激活巨噬细胞。活化的巨噬细胞进一步分泌和释放肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2) 等[5, 9, 23],参与炎症反应,进而导致系膜增生,足细胞完整性改变,血管内皮细胞泡沫化,最终引起肾小球硬化等肾损伤[10, 12-14]。因此,肾脏固有细胞、巨噬细胞及各种炎症分子交互调控,形成复杂的相互作用网络,值得人们关注。
随着对巨噬细胞的深入研究,认为它不仅介导肾组织炎性损伤,同时还参与肾组织损伤后的修复与重建[24-25]。在肾脏早期炎症阶段,巨噬细胞高表达iNOS和CD16/32(FcγRⅢ/Ⅱ),呈M1表型,而在肾组织修复阶段,巨噬细胞高表达精氨酸-1(arginine-1, Arg-1) 和甘露醇受体(mannose receptor, MR),呈M2表型[15]。另有研究表明[25],小鼠单侧输尿管结扎术后10 d解除梗阻,肾脏纤维化程度的减轻与巨噬细胞M2型标记物CD206(MR)相关。因而,巨噬细胞的不同活化状态决定肾脏疾病的发展方向[12-15]。
本实验构建了肾系膜细胞与巨噬细胞共培养模型,经AGEs刺激肾系膜细胞后,其MCP-1分泌水平提高,同时伴随巨噬细胞M1型标记蛋白iNOS、TNF-α、CD16/32的表达水平提高,M2型标记蛋白CD206和Arg-1的表达水平降低,而使用梓醇预孵再经AGEs刺激可逆转上述效应,提示梓醇可能通过减少系膜细胞分泌MCP-1,抑制巨噬细胞向M1型极化,促使其向M2型极化,但具体机制有待进一步深入研究。
[1] | Xue R, Gui D, Zheng L, et al. Mechanistic insight and management of diabetic nephropathy: recent progress and future perspective[J]. J Diabetes Res, 2017, 2017: 1839809. |
[2] | Kumar P A, Chitra P S, Reddy G B. Advanced glycation end products mediated cellular and molecular events in the pathology of diabetic nephropathy[J]. Biomol Concepts, 2016, 7(5-6): 293-309. |
[3] | Sun Y M, Su Y, Li J, et al. Recent advances in understanding the biochemical and molecular mechanism of diabetic nephropathy[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 433(4): 359-61. doi:10.1016/j.bbrc.2013.02.120 |
[4] | 吴云皓, 陈玉萍, 吕兴, 等. 马钱苷对糖基化终末产物诱导足细胞损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(3): 332-6. Wu Y H, Chen Y P, Lyu X, et al. Protective effect of loganin on podocyte injury induced by advanced glycation end products[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(3): 332-6. |
[5] | Jin X, Yao T, Zhou Z, et al. Advanced glycation end products enhance macrophages polarization into M1 phenotype through activating RAGE/NF-κB pathway[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015: 1-12. |
[6] | Schmidt A M. 2016 ATVB plenary lecture: receptor for advanced glycation endproducts and implications for the pathogenesis an treatment of cardiometabolic disorders: spotlight on the macrophage[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2017, 37(4): 613-21. doi:10.1161/ATVBAHA.117.307263 |
[7] | 刘超然, 邵云侠, 徐兴欣, 等. 芍药苷对AGEs刺激下RAW264.7巨噬细胞TLP2/4通路的影响[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(5): 675-80. Liu C R, Shao Y X, Xu X X, et al. Effect of paeoniflorinon TLR2/4 pathway in AGEs induced RAW264.7 maccrophages[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(5): 675-80. |
[8] | Murray P J, Allen J E, Biswas S K, et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines[J]. Immunity, 2014, 41(1): 14-20. doi:10.1016/j.immuni.2014.06.008 |
[9] | 郭银凤. 巨噬细胞活化表型与肾脏疾病[J]. 肾脏病与透析肾移植杂志, 2014, 23(3): 260-4. Guo Y F. Macrophage-activated phenotype and kidney disease[J]. Chin J Nephrol, Dial Transpl, 2014, 23(3): 260-4. |
[10] | You H, Gao T, Cooper T K, et al. Macrophages directly mediate diabetic renal injury[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2013, 305(12): F1719-27. doi:10.1152/ajprenal.00141.2013 |
[11] | Xu G, Qin Q, Yang M, et al. Heparanase-driven inflammation from the AGEs-stimulated macrophages changes the functions of glomerular endothelial cells[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2017, 124: 30-40. doi:10.1016/j.diabres.2016.12.016 |
[12] | Belliere J, Casemayou A, Ducasse L, et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury[J]. J Am Soc Nephrol, 2015, 26(6): 1363-77. doi:10.1681/ASN.2014040320 |
[13] | Anders H J, Ryu M. Renal microenvironments and macrophage phenotypes determine progression or resolution of renal inflammation and fibrosis[J]. Kidney Int, 2011, 80(9): 915-25. doi:10.1038/ki.2011.217 |
[14] | Cao Q, Wang Y, Harris D C. Pathogenic and protective role of macrophages in kidney disease[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2013, 305(1): F3-11. doi:10.1152/ajprenal.00122.2013 |
[15] | Lee S, Huen S, Nishio H, et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair[J]. J Am So Nephrol, 2011, 22(2): 317-26. doi:10.1681/ASN.2009060615 |
[16] | Rao J, Ye Z, Tang H, et al. The RhoA/ROCK pathway ameliorates adhesion and inflammatory infiltration induced by AGEs in glomerular endothelial cells[J]. Sci Rep, 2017, 7(5): 755-63. |
[17] | Ikezumi Y, Suzuki T, Karasawa T, et al. Activated macrophages down-regulate podocyte nephrin and podocin expression via stress-activated protein kinases[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 376(4): 706-11. doi:10.1016/j.bbrc.2008.09.049 |
[18] | 王静欢, 邹利, 万东, 等. 梓醇多效性相关信号通路研究进展[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(9): 1189-94. Wang J H, Zou Li, Wan D, et al. Review of catalpol's pleiotropic signaling pathways[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(9): 1189-94. |
[19] | Liu J Y, Zheng C Z, Hao X P, et al. Catalpol ameliorates diabetic atherosclerosis in diabetic rabbits[J]. Am J Transl Res, 2016, 8(10): 4276-8. |
[20] | Dong Z, Chen C X. Effect of catalpol on diabetic nephropathy in rats[J]. Phytomedicine, 2013, 20(11): 1023-9. doi:10.1016/j.phymed.2013.04.007 |
[21] | Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, et al. Macrophage-mediated glucolipotoxicity via myeloid-related protein 8/toll-like receptor 4 signaling in diabetic nephropathy[J]. Clin Exp Nephrol, 2014, 18(4): 584-92. doi:10.1007/s10157-013-0922-5 |
[22] | Tesch G H. MCP-1/CCL2: a new diagnostic marker and therapeutic target for progressive renal injury in diabetic nephropathy[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2008, 294(2): 697-701. |
[23] | Ma W, Stjacques B, Duarte P C. Targeting pain mediators induced by injured nerve-derived COX2 and PGE2 to treat neuropathic pain[J]. Expert Opin Ther Targets, 2012, 16(6): 527-40. doi:10.1517/14728222.2012.680955 |
[24] | Iseri K, Iyoda M, Ohtaki H, et al. Therapeutic effects and mechanism of conditioned media from human mesenchymal stem cells on anti-GBM glomerulonephritis in WKY rats[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2016, 310(11): F1182-91. doi:10.1152/ajprenal.00165.2016 |
[25] | Kushiyama T, Oda T, Yamada M, et al. Alteration in the phenotype of macrophages in the repair of renal interstitial fibrosis in mice[J]. Nephrology(Carlton), 2011, 16(5): 522-35. |