2. 国家中医药管理局重点研究室(心脑血管络病)，河北 石家庄 050035;
3. 泰安市中医医院脾胃科，山东 泰安 271000;
4. 国家中医药管理局中医络病学重点学科，河北 石家庄 050035;
5. 河北省络病重点实验室，河北 石家庄 050035
2. Key Lab of State Administration of TCM(Cardio-Cerebral Vessel Collateral Diseases), Shijiazhuang 050035, China;
3. Digestive Dept of Tai′an Traditional Chinese Medicine Hospital, Tai′an, Shandong 271000, China;
4. Key Disciplines of State Administration of TCM for Collateral Diseases, Shijiazhuang 050035, China;
5. Key Lab of Hebei Province for Collateral Diseases, Shijiazhuang 050035, China
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是心脑血管病和外周血管病变的主要原因。预计到2020年，AS将成为世界首要致死原因。既往研究表明，血管内皮细胞损伤、白细胞聚集、脂质沉积、斑块内血管新生、外膜滋养血管新生等都在AS的发生发展中起到重要作用，但AS发生发展的分子机制尚未充分阐明。随着对内皮间质转分化(endothelial-to-mesenchymal transition, EndMT)研究的深入，研究人员逐渐发现EndMT在AS的发生发展过程中也扮演着重要角色。本文将就EndMT在AS中的作用进行综述，以期为AS防治提供新的靶点和理论依据。
1 EndMTEndMT被认为是上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的一种亚型，是指内皮细胞失去其自身特性而获得间质细胞特性的表型转变过程。这些改变包括细胞形态变化、增殖和迁移能力增强、分泌胶原蛋白和纤维连接蛋白等细胞外基质及表达一些白细胞黏附分子，发生EndMT的内皮细胞可以从铺路石样形态转变成分散的纺锤形[1]。当前研究EndMT使用较多的内皮细胞标志分子有CD31、钙黏蛋白(VE-cadherin)、血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)、血管内皮细胞生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, Flk1) 和β-链蛋白(β-catenin)[2]。使用较多的间质细胞标志分子有平滑肌22α(smooth muscle 22α, SM22α)、α平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、成纤维细胞特异蛋白(fibroblast-specific protein-1, Fsp-1)、成纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein, FAP)[1-2]、骨钙素(osteocalcin, OC)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)、骨分化关键性转录因子Cbfa1和成骨细胞特异性转录因子Osterix[3]。
EndMT涉及到多种转录因子和信号通路的转导和调控[5]。研究发现，诱导EndMT的细胞因子至少需要通过一种转录因子的转导，锌指结合蛋白家族的Snail和Slug、锌指E盒结合同源蛋白ZEB1、ZEB2和Twist以及淋巴增强结合因子1(LEF1) 等都是诱导EndMT的常见转录因子。这些转录因子之间具有协同作用，而且某些转录因子通过共同的信号通路起作用。参与EndMT的主要信号通路有TGF-β/BMP信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路、RTK信号通路、Hypoxia信号通路。在EndMT发生过程中，各种信号通路之间相互影响。TGF-β信号可以激活Notch、Wnt信号通路，而Notch信号通路激活后对TGF-β又会产生抑制作用。β-catenin是Wnt信号通路的关键环节，同时β-catenin也能和HIF-α结合后转移至细胞核而促进EndMT的发生。此外，TGF-β激活EndMT需要通过转录因子Snail、Twist和Slug的表达来诱导Smad2/3/4复合物向细胞核转移。
氧化应激、缺氧、振荡剪切应力、炎症等促AS因素都可以导致EndMT的发生。在AS斑块部位存在明显的氧化应激，并且内膜斑块部位的氧化应激程度比外膜更为明显。过氧化氢(H2O2)是氧化应激的诱导因素，对H2O2处理的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)和人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells, HCAECs)进行检测发现，间质细胞相关基因表达上调，而内皮细胞基因表达下调，H2O2可以促进Smad3的表达和磷酸化[1]。缺氧也是氧化应激的一种诱发因素，随着动脉粥样硬化的发展，内膜斑块部位和外膜发生缺氧的细胞数量也随之增加。对缺氧处理的HCAECs进行检测也发现，间质细胞和成纤维细胞标志分子的基因和蛋白表达增加[1]。炎症和振荡剪切应力可以减少内皮细胞FGFR1的表达并促进TGF-β信号通路的活化，引起更多的内皮细胞发生EndMT，使得纤维连接蛋白沉积增加，最终导致动脉粥样硬化斑块负担加重[2]。
高血糖、高血脂、高血压是AS发生的3大主要基本原因。研究发现高糖能够直接刺激人主动脉内皮细胞(human aortic endothelial cells, HAECs)分泌血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)而诱导EndMT的发生[5]。Ox-LDL可以促进肾上皮细胞(NRK-52E)发生EMT[6]。Ox-LDL与凝集素样氧化低密度脂蛋白受体1(oxidized low density lipoprotein receptor-1, LOX-1) 结合可以促进NRK-52E细胞ROS和α-SMA的表达，而E-cadherin的表达反而减少。还有证据表明，ox-LDL可以和射线发生协同作用，增强射线诱导的EndMT[7]。而动脉保护性因素高密度脂蛋白(HDL)可以通过促进抑制性Smad(Smad7) 的表达而抑制EndMT的发生[8]。
2 EndMT促进动脉粥样硬化EndMT是包括心血管系统在内机体发育的基本过程之一。在心血管疾病中，EndMT参与肺动脉高压、心肌梗死、血管钙化、心脏纤维化等疾病的发生发展[4, 9]。近年研究表明EndMT也是AS的重要病理过程[3]。成纤维细胞可以调节炎症、细胞外基质和胶原蛋白的产生以及斑块的稳定性，在AS病变过程中占有重要地位。研究发现，在AS斑块中存在EndMT来源的具有成纤维细胞特征的细胞。Solene等[2]建立了敏感性和特异性均较高的可以进行内皮细胞示踪标记的end.SclCreERT; R26RstopYfp; ApoE-/-小鼠，他莫昔芬可以诱导内皮细胞特异性Cre表达并在不改变任何细胞表型的情况下持续显示黄色荧光以标记内皮细胞。对小鼠胸主动脉斑块进行检测发现Yfp+内皮细胞同时表达大量的Fap。而正常的内皮细胞并不表达Fap，说明斑块内确实发生了EndMT。并且在靠近脂质核心的部位EndMT的程度更大，内皮细胞来源的间质细胞表现出更为成熟的成纤维细胞表型；进一步研究发现，发生粥样硬化的动脉外膜也存在EndMT[1]。尸检结果发现，人AS斑块部位也存在同时表达内皮细胞和间质细胞标志分子的“转化”细胞，表明AS过程中确实发生了EndMT[1]。EndMT可以破坏内皮细胞的稳态，导致血管功能退化、AS斑块形成及移植静脉狭窄[1, 4]，EndMT与AS斑块钙化[3]和斑块的不稳定性[1]之间有着密切联系。
2.1 EndMT与动脉粥样硬化斑块钙化血管钙化是AS的常见特征，血管钙化与斑块负担增加和临床预后较差有关。血管钙化受振荡剪切应力、氧化应激、炎症等多种因素的调节，骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)是重要的促钙化因素，BMP Ⅰ型受体激酶抑制剂也可以减轻AS斑块的钙化[10]。基质Gla蛋白(matrix Gla protein, MGP)是BMP的抑制剂，过表达MGP可以抑制AS斑块的钙化。在AS斑块中MGP和BMP的表达均升高，但MGP不足以抑制BMP的过度活化。BMP活性升高可以诱导内皮细胞发生EndMT向成骨细胞分化而导致血管钙化[3, 11]。高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉EC中BMP4、BMP6、激活素受体样激酶(activin receptor-like kinase, ALK1, 2, 3)、BMPR2和MGP表达水平升高，VE-cadherin、vWF、Flk1等内皮细胞标志分子表达却减少，而性别决定区Y框蛋白2(sex-determining region Y-box2, SOX2)、Krüppel样因子4(Krüppel-like factor4, KLF4)、干细胞因子受体(c-Kit)、转录因子Slug、干细胞抗原-1(Stem cell antigen-1, Sca-1)、CD10、CD44、CD71、CD90和osterix、Cbfa1、osteocalcin、osteopontin等干细胞和间质细胞标志分子表达升高，并且在钙化的AS斑块中Sox2和cbfa1与vWF具有共定位现象[3]。表明AS斑块部位的内皮细胞发生了EndMT。耗竭Sox2可以减少EndMT，使用Sox2 shRNA可以抑制高脂喂养的ApoE-/-小鼠内皮细胞表达干细胞和间质细胞标志分子及斑块钙化[3, 12]。进一步研究发现，在高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉内皮细胞中丝氨酸蛋白酶复合物(elastase 1, 2和kallikrein 1, 5, 6) 表达升高，并且在钙化斑块中vWF和Sox2与elastase 1有共定位现象[4]。丝氨酸蛋白酶复合物可以调节Sox2的表达[12]，抑制丝氨酸蛋白酶复合物可以减轻AS斑块钙化[3]。
2.2 EndMT与动脉粥样硬化斑块不稳定性EndMT的程度与斑块不稳定性有关。依据1995年美国心脏病协会推出的AS斑块病理分型包括Ⅰ~Ⅵ共6种分型。其中Ⅴ型是在有较大脂质核心的基础上，出现一个厚的纤维帽，脂质核心上覆盖的仍然是正常内膜组织。当Ⅳ型和Ⅴ型的病变出现破裂出血、血肿、血栓等继发性病理变化时称为Ⅵ型[13]。尸检发现，人主动脉粥样硬化斑块中存在同时表达内皮细胞和间质细胞标志分子的细胞，而且在Ⅵ型斑块中这种发生EndMT的“转化”细胞数量比Ⅴ型斑块多，进一步研究发现斑块纤维帽的厚度和“转化”细胞的数量呈负相关，即“转化”细胞数量越多则纤维帽的厚度越薄[1]。说明斑块中发生EndMT的程度与斑块的不稳定性有直接关系。EndMT之所以会导致斑块的不稳定是因为发生EndMT的细胞其基因表达模式介于内皮细胞和经典的成纤维细胞之间。“转化”细胞表达的细胞外基质成分与成纤维细胞不同，成纤维细胞表达高水平的胶原蛋白和低水平的基质金属蛋白酶(除了基质金属蛋白酶3)，而“转化”细胞则表达大量的基质金属蛋白酶和低水平的胶原蛋白，内皮细胞发生EndMT破坏了胶原蛋白和基质金属蛋白酶之间的平衡而增加了斑块的不稳定性[1]。因为胶原蛋白含量是斑块稳定性的主要标志之一[14]，而基质金属蛋白酶与斑块的不稳定性有关[15]。对冠状动脉疾病患者的左主冠状动脉进行分子和形态学检查发现EndMT的程度与病情的严重性具有明显的临床相关性。左主冠状动脉的斑块程度越重则TGF-β信号通路活化程度越高，EndMT标志分子p-Smad2、Notch3、SM22α、ICAM-1、VCAM-1等的表达量也相应升高[2]。
3 非编码RNA与动脉粥样硬化EndMT非编码RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)是指不能编码蛋白质的RNA，按分子大小分为非编码小RNA(snoRNA、miRNA)和长链非编码RNA(LncRNA)。ncRNAs最初被认为是基因组转录的“噪音”，不具备生物学功能。近年来研究发现，ncRNA参与调控个体生长发育以及细胞分化、增殖、凋亡等生命活动[16]。在AS发病过程中，LncRNA参与调节AS相关的内皮细胞功能、血管平滑肌细胞功能、巨噬细胞活化、血管炎症、糖代谢、脂代谢、泡沫细胞形成等病理环节，目前研究较多的LncRNA有ANRIL、MALAT1、P21、H19等[17]。参与AS的miRNA有miR-10a、miR-19a、miR-155、miR-21、miR-126等[18]，并且miRNA也参与了EndMT过程[19]。此外，LncRNA MALAT1、H19、P21也参与肿瘤相关的EMT过程[20]。
4 动脉粥样硬化常见防治药物对上皮间质转分化的作用他汀类药物是HMG-CoA还原酶抑制剂，广泛用于AS的防治。他汀类药物不仅可以降低细胞内胆固醇合成，还具有抗炎和免疫调节作用。多项研究表明他汀类药物具有抑制EMT作用。辛伐他汀可以通过制PI3K/Akt/β-catenin信号通路而抑制香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞的间质转分化[21]；还可以通过下调TLR4和NF-κB磷酸化抑制LPS或TGF-β1诱导的胆管上皮细胞(H69) 发生间质转分化[22]；对于TGF-β1诱导的前列腺癌细胞(DU145) 的间质转分化也可以通过下调p38MAPK的磷酸化发挥抑制作用[23]。阿托伐他汀下调SphK1可以抑制TGF-β1诱导的人非小细胞肺癌细胞(A549) 的间质转分化[24]。
常用抗凝药阿司匹林也具有抑制EndMT作用。研究表明，阿司匹林触发的D类消退素可以通过调节Smad7的表达和氧化应激，抑制TGF-β1诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)间质转分化过程[25]，还可以通过减少丙酮酸激酶M2的表达抑制mTOR信号通路，从而抑制TGF-β1诱导的人非小细胞肺癌(A549) 细胞发生间质转分化[26]。此外，还有研究表明阿司匹林可以抑制NF-κBp65的核转位而减少原癌基因K-ras的表达，并进一步下调E-cadherin转录抑制剂Slug的表达，从而抑制A549细胞的间质转分化[27]。
通心络胶囊是心血管病的有效治疗药物，可以从多方面发挥防治AS作用[28]。近期研究表明，通心络胶囊可以通过调控miR-21/TGF-β1/Smads信号通路抑制肾小管上皮细胞发生EMT，保护糖尿病肾病小鼠的肾脏结构和功能[29]。通心络胶囊还可以通过调控TGF-β1/Notch/Jagged1/VEGF信号通路和Hif-1α/TGF-β1/ Smad2/CTGF信号通路抑制心梗后EndMT，改善心梗后心室重塑[30]。
5 结语上述研究表明，EndMT是AS的重要病理变化之一。非编码RNA可能参与AS的EndMT过程，非编码RNA将成为抑制EndMT防治AS的重要靶点。抑制EndMT可能是他汀类药物、阿司匹林和通心络胶囊等常用药防治AS的作用机理之一。研究EndMT对于更深入的了解AS病理机制及新药开发具有重要作用。
| [1] | Evrard S M, Lecce L, Michelis K C, et al. Endothelial to mesenchymal transition is common in atherosclerotic lesions and is associated with plaque instability[J]. Nat Commun, 2016, 7: 11853. doi:10.1038/ncomms11853 |
| [2] | Chen P Y, Qin L, Baeyens N, et al. Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression[J]. J Clin Invest, 2015, 125(12): 4514-28. doi:10.1172/JCI82719 |
| [3] | Boström K I, Yao J, Guihard P J, et al. Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification[J]. Atherosclerosis, 2016, 253: 124-7. doi:10.1016/j.atherosclerosis.2016.08.046 |
| [4] | 刘艳华, 李宾. 内皮间质转分化在心血管疾病中的研究进展[J]. 医学研究生学报, 2016, 29(8): 872-6. Liu Y H, Li B. Research progress of endothelial mesenchymal transition in cardiovascular disease[J]. J Med Postgrad, 2016, 29(8): 872-6. |
| [5] | Tang R, Li Q, Lv L, et al. Angiotensin Ⅱ mediates the high-glucose-induced endothelial-to-mesenchymal transition in human aortic endothelial cells[J]. Cardiovasc Diabetol, 2010, 9: 31. doi:10.1186/1475-2840-9-31 |
| [6] | Wang R, Ding G, Liang W, et al. Role of LOX-1 and ROS in oxidized low-density lipoprotein induced epithelial-mesenchymal transition of NRK52E[J]. Lipids Health Dis, 2010, 9: 120. doi:10.1186/1476-511X-9-120 |
| [7] | Kim M, Choi S H, Jin Y B, et al. The effect of oxidized low-density lipoprotein(ox-LDL) on radiation-induced endothelial-to-mesenchymal transition[J]. Int J Radiat Biol, 2013, 89(5): 356-63. doi:10.3109/09553002.2013.763193 |
| [8] | Spillmann F, Miteva K, Pieske B, et al. High-density lipoproteins reduce endothelial-to-mesenchymal transition[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2015, 35(8): 1774-7. doi:10.1161/ATVBAHA.115.305887 |
| [9] | 王丹姝, 方莲花, 杜冠华. 转化生长因子β1在肺动脉高压中作用的研究进展[J]. 中国药理学通报, 2017, 33(6): 741-4. Wang D S, Fang L H, Du G H. Research progress on role of TGF-β1 in pulmonary artery hypertension[J]. Chin Pharmacol Bull, 2017, 33(6): 741-4. |
| [10] | Derwall M, Malhotra R, Lai C S, et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32(3): 613-22. doi:10.1161/ATVBAHA.111.242594 |
| [11] | Yung L M, Sánchez-Duffhues G, Ten Dijke P, et al. Bone morphogenetic protein 6 and oxidized low-density lipoprotein synergistically recruit osteogenic differentiation in endothelial cells[J]. Cardiovasc Res, 2015, 108(2): 278-87. doi:10.1093/cvr/cvv221 |
| [12] | Yao J, Guihard P J, Blazquez-Medela A M, et al. Serine protease activation essential for endothelial-mesenchymal transition in vascular calcification[J]. Circ Res, 2015, 117(9): 758-69. doi:10.1161/CIRCRESAHA.115.306751 |
| [13] | Stary H C, Chandler A B, Dinsmore R E, et al. A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis. A report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995, 15(9): 1512-31. doi:10.1161/01.ATV.15.9.1512 |
| [14] | Kuzan A, Chwiłkowska A, Pezowicz C, et al. The content of collagen type Ⅱ in human arteries is correlated with the stage of atherosclerosis and calcification foci[J]. Cardiovasc Pathol, 2017, 28: 21-7. doi:10.1016/j.carpath.2017.02.003 |
| [15] | Lin J, Kakkar V, Lu X. Impact of matrix metalloproteinases on atherosclerosis[J]. Curr Drug Targets, 2014, 15(4): 442-53. doi:10.2174/1389450115666140211115805 |
| [16] | Wei J W, Huang K, Yang C, et al. Non-coding RNAs as regulators in epigenetics[J]. Oncol Rep, 2017, 37(1): 3-9. doi:10.3892/or.2016.5236 |
| [17] | Zhou T, Ding J W, Wang X A, et al. Long noncoding RNAs and atherosclerosis[J]. Atherosclerosis, 2016, 248: 51-61. doi:10.1016/j.atherosclerosis.2016.02.025 |
| [18] | Loyer X, Mallat Z, Boulanger C M, et al. MicroRNAs as therapeutic targets in atherosclerosis[J]. Expert Opin Ther Targets, 2015, 19(4): 489-96. doi:10.1517/14728222.2014.989835 |
| [19] | Lin C W, Kao S H, Yang P C. The miRNAs and epithelial-mesenchymal transition in cancers[J]. Curr Pharm Des, 2014, 20(33): 5309-18. doi:10.2174/1381612820666140128204508 |
| [20] | Dhamija S, Diederichs S. From junk to master regulators of invasion: lncRNA functions in migration, EMT and metastasis[J]. Int J Cancer, 2016, 139(2): 269-80. doi:10.1002/ijc.30039 |
| [21] | Milara J, Peiró T, Serrano A, et al. Simvastatin increases the ability of roflumilast N-oxide to inhibit cigarette smoke-induced epithelial to mesenchymal transition in well-differentiated human bronchial epithelial cells in vitro[J]. COPD, 2015, 12(3): 320-31. |
| [22] | Kim Y, Lee E J, Jang H K, et al. Statin pretreatment inhibits the lipopolysaccharide-induced epithelial-mesenchymal transition via the downregulation of toll-like receptor 4 and nuclear factor-κB in human biliary epithelial cells[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2016, 31(6): 1220-8. doi:10.1111/jgh.2016.31.issue-6 |
| [23] | Xie F, Liu J, Li C, et al. Simvastatin blocks TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition in human prostate cancer cells[J]. Oncol Lett, 2016, 11(5): 3377-83. |
| [24] | Fan Z, Jiang H, Wang Z, et al. Atorvastatin partially inhibits the epithelial-mesenchymal transition in A549 cells induced by TGF-β1 by attenuating the upregulation of SphK1[J]. Oncol Rep, 2016, 36(2): 1016-22. doi:10.3892/or.2016.4897 |
| [25] | Shu Y, Liu Y, Li X, et al. Aspirin-triggered resolvin D1 inhibits TGF-β1-induced EndMT through increasing the expression of Smad7 and is closely related to oxidative stress[J]. Biomol Ther(Seoul), 2016, 24(2): 132-9. doi:10.4062/biomolther.2015.088 |
| [26] | Liu Y, Yuan X, Li W, et al. Aspirin-triggered resolvin D1 inhibits TGF-β1-induced EMT through the inhibition of the mTOR pathway by reducing the expression of PKM2 and is closely linked to oxidative stress[J]. Int J Mol Med, 2016, 38(4): 1235-42. doi:10.3892/ijmm.2016.2721 |
| [27] | Khan P, Manna A, Saha S, et al. Aspirin inhibits epithelial-to-mesenchymal transition and migration of oncogenic K-ras-expressing non-small cell lung carcinoma cells by down-regulating E-cadherin repressor Slug[J]. BMC Cancer, 2016, 16: 39. doi:10.1186/s12885-016-2078-7 |
| [28] | 李红蓉, 张肖, 常丽萍, 等. 通心络胶囊抗动脉粥样硬化研究进展[J]. 中成药, 2016, 38(2): 386-91. Li H R, Zhang X, Chang L P, et al. The research progression on anti-atherosclerosis of Tongxinluo[J]. Chin Tradit Patent Med, 2016, 38(2): 386-91. |
| [29] | Wang J Y, Gao Y B, Zhang N, et al. Tongxinluo ameliorates renal structure and function by regulating miR-21-induced epithelial-to-mesenchymal transition in diabetic nephropathy[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2014, 306(5): F486-95. doi:10.1152/ajprenal.00528.2013 |
| [30] | 王思颖. 通心络对大鼠心肌梗死缺血区微血管新生及纤维化的作用机制研究[D]. 北京: 北京中医药大学, 2016. Wang S Y. Effect of Tongxinluo on angiogenesis and fibrosis in myocardial ischemia zone of rats[D].Beijing: Beijing University of Chinese Medicine, 2016. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10026-1016071461.htm |