2. 沈阳医学院 辽宁省环境污染与微生态重点实验室，辽宁 沈阳 110034
2. Key Lab of Environmental Pollution and Microecology of Liaoning Province, Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China
乳腺癌是常见女性恶性肿瘤，其中70%的患者为雌激素受体α(estrogen receptor α，ERα)阳性。ERα阳性的乳腺癌MCF-7细胞，其生长与增殖主要受ER信号系统驱动，此信号系统亦可被瘦素(Leptin)信号系统所激活[1]。女性体内瘦素水平增加，其患高恶性、低分化且预后不良的乳腺癌几率大大增加[2]。p21WAF1/CIP1是细胞周期依赖性蛋白激酶抑制剂，可使细胞周期停滞、促进细胞凋亡并抑制癌细胞的转移和侵袭。本研究的前期工作证实，瘦素处理后的小鼠乳腺癌4T1细胞p21WAF1/CIP1 mRNA及蛋白表达水平远远低于瘦素未处理组细胞[3]。组蛋白去乙酰化酶1 (histone deacetylases 1，HDAC1) 使组蛋白去乙酰化，可与一些调控肿瘤发生发展的基因启动子区结合，抑制这些基因的转录。辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)是目前已知最经典的HDAC抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)之一, 可抑制组蛋白去乙酰化酶活性，通过上调p21WAF1/CIP1引起细胞周期阻滞于G1期而抑制细胞增殖[4]。本实验旨在寻找HDAC1及ERα共同募集于p21WAF1/CIP1启动子区，调控其转录活性的具体作用位点，明确SAHA及瘦素在调节p21WAF1/CIP1启动子功能过程中的分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料人乳腺癌细胞株MCF-7(美国ATCC细胞库), SAHA(Sigma), Leptin(Sigma), 完全型RPMI 1640培养液(Thermo), 改良型RPMI 1640培养液(Thermo), 磷酸盐缓冲液1×(Thermo), 0.25%胰酶-EDTA(Gibco), 89890 ZebaTM脱盐离心柱(Thermo), PierceTM Agarose ChIP试剂盒(Thermo), HDAC1及ERα抗体(Abcam), Power SYBR® Green PCR Master Mix(Life technologies), p21WAF1/CIP1 f1~f10引物(上海生工生物工程有限公司)。超净工作台(Thermo)、CO2恒温细胞培养箱(Thermo), Biofuge 28RS低温高速离心机(Heraeus), 倒置显微镜(Olympus), SK-D1807-E摇床(Scilogex), 恒温混匀器(Eppendorf), 7500 Real-time PCR仪(Life technologies)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将MCF-7细胞接种在完全型RPMI 1640培养液(10%胎牛血清，青霉素、链霉素100 kU·L-1)中，37℃、5% CO2孵箱饱和湿度条件下贴壁传代培养，每2~3 d换液并传代1次。0.25%胰酶-EDTA消化。经2~3次传代, 取对数生长期的细胞等量分成3组，分别接种于完全型RPMI 1640培养液中，24 h后，再将细胞置于改良型RPMI 1640培养液中进行同步化处理24 h。此后，将3组细胞分别定义为SAHA组(完全型RPMI 1640培养液10 mL+20 μmol·L-1 SAHA 0.88 μL)、Leptin组(完全型RPMI 1640培养液10 mL+0.625 nmol·L-1 Leptin 10 μL)、Basal对照组(等量完全型RPMI 1640培养液)。
1.2.2 先后使用HDAC1及Eα抗体经两次ChIP (即ChIP-on-ChIP)方法处理样品MCF-7细胞的甲醛交联及细胞团的分离；细胞溶解及MNase消化，每组样品各得到50 μL的MNase消化产物，留取5 μL -20℃保存作为内对照，45 μL进行下一步的免疫沉淀处理，免疫沉淀过程中需向每个ChIP样品加入HDAC1抗体10 μg；HDAC1抗体-组蛋白-DNA免疫沉淀洗脱：向免疫沉淀物中加入150 μL 1×IP洗脱液，室温振荡孵育30 min，再加入150 μL 1×IP洗脱液，室温振荡孵育10 min。3 000×g 2 min离心收集洗脱下来的免疫沉淀物，将洗脱复合物置于到经1×IP稀释液预处理的Zeba脱盐洗脱柱上(参见操作手册)，1 000×g离心2 min收集样品。向各组样品中加入1×IP稀释液至500 μL，加入Eα抗体7.5 μg，进行再次免疫沉淀(参见操作手册)，最终3组MCF-7细胞均获得使用HDAC1及Eα抗体进行2次ChIP得到的DNA及各自的内对照。
1.2.3 Real-time PCR检测各组p21WAF1/CIP1 f1~f10片段的DNA相对表达PCR反应体系为25 μL：DNA 1.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，PCR Master Mix 12.5 μL, ddH2O 9.5 μL。反应条件为：50℃ 2 min, 95℃ 10 min预变性, 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 共40个循环。每个样品3个复孔，采用2-△△CT法计算各组DNA的相对表达量。p21WAF1/CIP1启动子区的10个片段的引物序列为：f1：Forward 5′-TCCTCCTGGAGAGTGCCAAC-3′，Reverse 5′-TTGGTGCGCTGGACACATTT-3′；f2：Forward 5′-TTCCCGGAAGCATGTGACAA-3′，Reverse 5′-GCACCTGGAGCACCTAG ACACC-3′；f3：Forward 5′-CCCGTTTCCCCAGCAGTGTA-3′，Reverse 5′-GCCAGGAAGGGGAGGATTTG-3′；f4：Forward 5′-AGGCCAAGGGGGTCTGCTAC-3′，Reverse 5′-CGGGGAGGACAGGCTTCTTT-3′；f5：Forward 5′-TGAAAGCAGAGGGGCTTCAA-3′，Reverse 5′-ACCATCCAAAGGGCTGGTTG-3′；f6：Forward 5′-TGTCCTTGGGCTGCCTGTTT-3′，Reverse 5′-AGCCCTGTCG CAAGGATCTG-3′；f7：Forward 5′-TTCTGCAGCCACCACTGAGC-3′，Reverse 5′-GTGGAGCAGCATGGGGTAGG-3′；f8：Forward5′-CCCACCTCAGCCACCTGAA T-3′，Reverse 5′-GGGCAGATCACAGGGTCAGG-3′；f9：Forward 5′-AGTGGGCACATTTAGACATAGCAGG T-3′，Reverse 5′-CCTCCCGGTCATGCCTTT C-3′；f10：Forward 5′-GTCAGGTGCCACTGGGGTCT-3′，Reverse 5′-CGGTCCCCTGTTTCAATGCT-3′。p21WAF1/CIP1启动子区+2~ -4000 bp 10个选定区域f1~f10(Fig 1)。
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| Fig 1 Schematic diagram of HDAC1 and ERα response element for regulating transcriptional function of p21WAF1/CIP1 promoter |
所有数据均用x±s表示，采用SPSS17.0统计软件分析，采用方差分析进行统计学处理。
2 结果 2.1 Basal组MCF-7细胞p21WAF1/CIP1启动子区f1~f10片段HDAC1及ERα高功能结合位点筛选Basal组MCF-7细胞经HDAC1及ERα抗体2次ChIP处理后，45 μL样品与5 μL内对照的DNA分别与f1~f10引物作用进行Real-time PCR扩增，所得CT值之差为该样品在p21WAF1/CIP1启动子区各自片段的ΔCT值，再以f4片段为对照，其他片段的△CT值与其相减，得到Basal组样品在p21WAF1/CIP1启动子区f1~f10片段各自△△CT值，采用2-△△CT法计算各片段DNA的相对表达量。Basal组f1~f3、f5~f10片段DNA的相对表达量为(1.93±0.13)、(1.31±0.07)、(1.44±0.09)、(1.77±0.08)、(1.32±0.09)、(1.75±0.15)、(2.81±0.36)、(1.76±0.07)、(2.48±0.18)，较f4片段相对表达量(1±0) 明显升高(P＜0.01)，f8片段达最高值(Fig 2)。
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| Fig 2 Screening of high function bind site of HDAC1 and ERα among f1~f10 fragments of p21WAF1/CIP1 promoter region in basal group MCF-7 cells **P < 0.01 vs f4 fragment |
将SAHA处理后的MCF-7细胞的DNA组分，经HDAC1及ERα抗体2次ChIP处理后，进行Real-time PCR检测。结果表明，SAHA组MCF-7细胞的p21WAF1/CIP1启动子f1及f8片段结合HDAC1及ERα抗体的DNA相对表达量为(0.51±0.04)、(0.41±0.04)，较Basal组对应片段相对表达量(1±0) 均明显降低(P＜0.01)，见Fig 3。
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| Fig 3 Screening of high function bind site of HDAC1 and ERα among f1~f10 fragments of p21WAF1/CIP1 promoter region in SAHA group MCF-7 cells **P < 0.01 vs basal group |
将Leptin处理后的MCF-7细胞的DNA组分，经HDAC1及ERα抗体2次ChIP处理后，进行Real-time PCR检测。结果表明，Leptin组细胞p21WAF1/CIP1启动子区f1~f3、f6~f10片段结合HDAC1及ERα抗体的DNA相对表达量为(1.28±0.06)、(1.12±0.07)、(1.32±0.08)、(1.66±0.17)、(1.66±0.15)、(1.80±0.22)、(1.48±0.14)、(1.32±0.25)，较Basal组对应片段相对表达量(1±0) 均明显升高(P＜0.01)，f8片段达最高值(Fig 4)。
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| Fig 4 Screening of high function bind site of HDAC1 and ERα among f1~f10 fragments of p21WAF1/CIP1 promoter region in Leptin group MCF-7 cells **P < 0.01 vs basal group |
SAHA、Leptin组MCF-7细胞p21WAF1/CIP1启动子区f1片段结合HDAC1及ERα抗体的DNA相对表达量为(0.51±0.04)、(1.28±0.06)，与Basal组对应片段相对表达量(1±0) 相比，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见Fig 5。
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| Fig 5 Comparison of high function bind of HDAC1 and ERα in f1 fragment of p21WAF1/CIP1 promoter region in MCF-7 cells among SAHA, Basal and Leptin group **P < 0.01 vs basal group |
SAHA、Leptin组MCF-7细胞p21WAF1/CIP1启动子区f8片段结合HDAC1及ERα抗体的DNA相对表达量为(0.41±0.06)、(1.80±0.22)，与Basal组对应片段相对表达量(1±0) 相比，差异均有统计学意义(P＜0.01)，见Fig 6。
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| Fig 6 Comparison of high function bind of HDAC1 and ERα in f8 fragment of p21WAF1/CIP1 promoter region in MCF-7 cells among SAHA, Basal and Leptin group **P < 0.01 vs basal group |
乳腺癌MCF-7细胞为ER阳性的乳腺癌经典细胞系，其ERα位于细胞核内，是雌激素激活的转录因子，通过调节特异性靶基因的转录而发挥基因型调节效应。雌激素应答成分(estrogen response element, EREs)位于雌激素应答靶基因的启动子区，ERα可直接结合到EREs或通过与AP1、SP1、MTA1、HDAC1等其他转录因子结合，调控靶基因的转录，促进乳腺癌细胞的增生[5]。乳腺癌MCF-7细胞引起癌前病变及癌肿中ERα的表达均增高[6]。ERα是乳腺癌细胞增殖过程中的重要调控因素, ERα基因的表达及其转录活性的调控都离不开HDACs的参与[7], 尤其是HDAC1和HDAC7[8]。
本实验利用ChIP-on-ChIP方法研究发现，Basal组MCF-7细胞p21WAF1/CIP1基因TSS近端启动子调节区f1~f3和远端调节区f5~f10片段结合HDAC1及ERα抗体的DNA相对表达量较f4片段明显升高。这表明在细胞增殖过程中，HDAC1及ERα可被招募至p21WAF1/CIP1启动子区，其中f1及f8片段均与之有较高能力的结合。
在乳腺癌细胞增殖过程中，细胞增殖信号在p21WAF1/CIP1的启动子区可招募HDAC1转录因子，通过组蛋白去乙酰化表观遗传修饰影响p21WAF1/CIP1表达。前期研究证实，SAHA可降低HDAC1在p21WAF1/CIP1启动子区的结合[9]。此外，HDACi也显示出对ERα基因表达的下调作用[10]。SAHA可以从转录水平抑制ERα合成，同时可以通过增强Hsp90乙酰化修饰，促进ERα经泛素-蛋白酶体通路降解[11]。本研究发现，SAHA作用下的MCF-7细胞，p21WAF1/CIP1启动子区f1及f8片段结合HDAC1及ERα抗体的DNA相对表达量明显低于对照组，这表明f1及f8片段可能是SAHA发挥作用的功能敏感区。
Leptin可通过调控细胞周期、凋亡、影响细胞外环境等多重机制，促进雌激素受体阳性的MCF-7乳腺癌细胞增殖与转移[12]。Leptin可提高HDAC1的活性，使核心组蛋白去乙酰化，从而抑制p21WAF1/CIP1的表达，最终促进细胞周期从G1期到S期的进程[13]。另有报道，Leptin可通过促进芳香酶的表达，导致雌激素生成增多[14]，也可上调乳腺癌MCF-7细胞中ERα的表达水平[15]。本实验中，Leptin作用下的MCF-7细胞，p21WAF1/CIP1启动子区f1~f3及f6~f10片段结合HDAC1及ERα抗体的DNA相对表达量较对照组增多，但根据SAHA组细胞p21WAF1/CIP1启动子区各片段结合HDAC1及ERα抗体情况的筛选结果，可以推断在乳腺癌发生、发展过程中，f1及f8片段可能是Leptin与SAHA均发挥作用的功能敏感区。
综上所述，本研究通过ChIP on ChIP实验技术筛选出Basal组乳腺癌MCF-7细胞p21WAF1/CIP1启动子区的HDAC1及ERα高功能结合位点，进而利用SAHA及Leptin的药理学特征，使用SAHA及Leptin对MCF-7细胞进行分组处理，ChIP on ChIP 2次抗体结合后DNA检测，进一步明确p21WAF1/CIP1启动子区0~400 bp、-2 800~-3 200 bp两区域可能是与HDAC1和ERα高度结合的功能活跃区。此研究发现丰富了SAHA和Leptin在调节p21WAF1/CIP1启动子功能过程中的分子机制，更为抗乳腺癌的药物研发及靶向治疗奠定了理论和实验基础。
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