2. 青岛大学医学院病理学教研室，山东 青岛 266071
2. Dept of Pathology, Medical College of Qingdao University, Qingdao Shandong 266071, Chin
维生素D(vitamin D, VD)的经典生物学作用是调节钙磷平衡，维持骨骼健康[1]。近年的研究发现，VD3具有抗炎、抗氧化等生物学作用。有文献指出，VD3补充对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤具有明显的改善作用[2]。但其对药物性肝损伤是否具有保护作用，尚未见报道。本研究以异烟肼联用利福平建立小鼠肝损伤模型，探讨不同剂量VD3补充对肝损伤是否具有保护作用。
1 材料与方法 1.1 材料异烟肼(安徽东盛制药)，利福平(沈阳红旗制药)，维生素D滴剂(青岛双鲸药业)，复方甘草酸苷胶囊(潍坊中狮制药)。
1.2 分组及检测指标50只SPF级♂昆明种小鼠, 体质量(20±2) g，购自山东省鲁抗制药公司，合格证号：SCXK(鲁)20140001。适应性喂养1周后，随机分成5组：正常对照组(NC)、模型组(M)、5倍、10倍VD3生理剂量组(5N、10N)、阳性对照组(PC)。除NC组外，其余4组一次性给予异烟肼和利福平各100 mg·kg-1·d-1，制备肝损伤模型[3]；NC组给予等剂量溶剂灌胃。1 h后，5N、10N组分别给予5倍、10倍生理剂量的VD3，剂量分别为180 IU·kg-1·d-1、360 IU·kg-1·d-1；PC组给予200 mg·kg-1·d-1复方甘草酸苷胶囊；NC组和M组均给予等剂量溶剂灌胃。连续灌胃2周后，测空腹血糖，处死小鼠，分离血清，检测肝功能及脂质指标，计算肝脏指数，HE染色观察肝脏病理学改变。
1.3 统计学分析采用SPSS20.0进行统计分析。数据用x±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较。
2 结果 2.1 VD3对小鼠体质量、肝湿重和肝脏指数的影响各组小鼠之间体质量差异无统计学意义。与NC组相比，M组的肝湿重、肝脏指数明显增大；不同剂量的VD3干预后肝湿重和肝脏指数明显降低(Tab 1)。
| Group | Weight_end/g | Liver weight/g | Liver index/% |
| NC | 36.761±3.201 | 1.773±0.238 | 4.820±0.336 |
| M | 37.677±2.931 | 2.711±0.371** | 7.180±0539** |
| 5N | 37.257±4.493 | 2.158±0.244**△△# | 5.216±0.003△△ |
| 10N | 38.594±3.291 | 2.178±0.145**△△# | 5.660±0.530*△△ |
| PC | 34.732±3.851 | 1.910±0.237△△ | 5.490±0.321△△ |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC; △△P < 0.01 vs M; #P < 0.05 vs PC | |||
与NC组相比，M组血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、直接胆红素(direct bilirubin, DBIL)、总胆红素(total bilirubin, TBIL)的活性及空腹血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、胆固醇(cholestrol, CHOL)水平都明显升高。VD3补充能降低ALT、ALP、DBIL、TBIL的活性及TG水平；5N、10N组之间差异没有显著性。但5N组能明显降低血清AST活性、空腹血糖及CHOL水平(Tab 2、3)。
| Group | ALT/U·L-1 | AST/U·L-1 | ALP/U·L-1 | DBIL/μmol·L-1 | TBIL/μmol·L-1 | TP/g·L-1 |
| NC | 29.90±5.55 | 87.50±22.73 | 189.30±47.26 | 0.74±0.28 | 0.42±0.31 | 64.39±3.88 |
| M | 61.50±18.98** | 119.50±23.64** | 263.20±30.95** | 4.23±1.31** | 5.21±1.91** | 57.98±5.71** |
| 5N | 40.80±8.31*△△ | 91.40±12.59△△ | 219.50±37.78△ | 2.46±0.68**△△## | 2.76±1.00**△△## | 61.07±3.31 |
| 10N | 43.10±14.52*△△ | 106.40±21.85* | 214.60±23.97△△ | 1.94±0.27**△△## | 1.96±0.38**△△## | 64.31±2.58△△ |
| PC | 42.60±11.54*△△ | 101.00±17.80△ | 238.50±47.96** | 1.52±0.30**△△ | 1.49±0.36**△△ | 63.41±2.73△△ |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC; △P < 0.05, △△P < 0.01 vs M; ##P < 0.01 vs PC | ||||||
| Group | Glucose/mmol·L-1 | TG/mmol·L-1 | CHOL/mmol·L-1 |
| NC | 4.72±0.59 | 0.60±0.11 | 2.94±0.18 |
| M | 7.06±0.99** | 1.41±0.49** | 3.56±0.50** |
| 5N | 5.73±0.84**△△ | 0.72±0.14*△△## | 2.99±0.31△△▲▲ |
| 10N | 6.82±0.81**## | 0.70±0.05*△△## | 3.60±0.32** |
| PC | 5.40±0.77△△ | 1.21±0.25** | 3.30±0.57 |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs NC; △△P < 0.01 vs M; ##P < 0.01 vs PC; ▲▲P < 0.01 vs 10N | |||
在相同放大倍数光学显微镜下观察发现，M组与NC组肝细胞的直径比为1 :0.7。M组大部分肝细胞肿胀，发生气球样变，点灶状性坏死，并伴有大量炎性细胞浸润。与M组相比，VD3干预组与PC组肝细胞损伤明显减轻。
3 讨论血清中转氨酶水平的升高是药物引起肝细胞坏死性病变的标志[3]，当肝细胞膜及线粒体膜损伤导致通透性增加时，这些诊断标记酶释放进入血液，导致血清中ALT、AST活性升高。VD3干预能明显降低血清ALT、ALP、TBIL、DBIL水平。新近研究表明，抗结核药物抑制胆汁分泌，导致胆固醇蓄积和肝脏脂质代谢受损[4]。我们研究发现，VD3补充能够降低CHOL、TG水平，推测其可能通过调节脂质代谢对肝脏起保护作用。
从肝脏指数、AST、血糖、CHOL等指标来看，5倍VD3补充对抗结核药所致小鼠肝损伤的保护作用更为明显，而10倍VD3补充对这些指标未观察到类似效果。因此，我们推测一定范围内大剂量VD3补充对抗结核药所致肝损伤具有一定的保护作用，其作用机制有待进一步深入研究。
( 致谢: 本实验是在青岛大学医学院医学营养研究所实验室完成，在此对实验过程给予指导和帮助的老师和同学表示感谢！)
| [1] | 窦晓娟, 汪求真, 韩孝红, 等. 大剂量维生素D3补充对糖尿病大鼠淋巴细胞增殖活性的影响[J]. 中国药理学通报, 2016, 32(4): 589-90. Dou X J, Wang Q Z, Han X H, et al. Effect of high dosage of vitamin D3 supplementation on lymphocyte proliferation activity in diabetic rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32(4): 589-90. |
| [2] | 朴美兰. 维生素D3对四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤的保护作用[D]. 延边: 延边大学, 2013. Piao M L. Protective effects of vitamin D3 on acute liver injury induced by CCl4 in mice[D]. Yanbian: Yanbian University, 2013. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10184-1013321049.htm |
| [3] | Dong Y, Huang J, Lin X, et al. Hepatoprotective effects of Yulangsan polysaccharide against isoniazid and rifampicin-induced liver injury in mice[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 152(1): 201-6. doi:10.1016/j.jep.2014.01.001 |
| [4] | Pal R, Rana S V, Vaiphei K, et al. Isoniazid-rifampicin induced lipid changes in rats[J]. Clin Chim Acta, 2008, 389(1-2): 55-60. doi:10.1016/j.cca.2007.11.028 |