2. 湖南中医药大学 湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地、中药粉体关键技术及装备国家地方联合工程实验室，湖南 长沙 410208;
3. 湖南中医药大学 医学院，湖南 长沙 410208
2. National Key Lab Co-built by Depts of Herbal Powder and New Drugs of Hunan Province, Traditional Chinese Medicine Powder Technology and Equipment of National and Local Joint Engineering Lab, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China;
3. Medical School, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China
补阳还五汤精简方遵循补阳还五汤之方义[1]，基于益气祛瘀生新法，秉承“瘀血不去，新血不生”和“不破不立，瘀祛新生”的观念，以黄芪30 g、川芎9 g、地龙3 g的比例入药，并采用现代中药制备工艺提取。课题组前期通过动物实验确立了补阳还五汤精简方发挥抗脑缺血功效的有效剂量[2]，并阐明了其抗脑缺血损伤的部分分子机制[3-4]。然而，脑缺血对海马组织神经元损伤的机制非常复杂，仅通过对几个蛋白的研究不足以体现中药多靶点的协同作用。周期素依赖性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5, Cdk5) 作为一种主要在神经元内表达的脯氨酸限定的丝/苏氨酸蛋白激酶，在调控神经元分化、皮质的形成、神经元的迁移和神经轴突的生长过程中起着至关重要的作用，具有潜在的调控神经元功能[5]。早在1999年，Patrick等[6]研究报道了Cdk5的调节亚基p35在钙激活性蛋白酶水解作用下裂解成p25，继而导致Cdk5长期连续不可调控性激活，从而加速神经元损伤。鉴于Cdk5的异常活化对神经元的损伤性，本研究动态研究补阳还五汤精简方对大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠海马组织Cdk5表达的影响，并比较原方及精简方对Cdk5的调控程度，旨在从分子层面为补阳还五汤精简方的有效性和合理性提供科学依据。
1 材料 1.1 药物与试剂补阳还五汤干浸膏(黄芪120 g、当归6 g、赤芍4.5 g、川芎93 g、红花3 g、桃仁3 g、地龙3 g)和补阳还五汤精简方干浸膏(黄芪30 g、川芎9 g、地龙6 g)均由湖南中医研究院中药所张水寒教授提供，干浸膏的制备程序参照前期研究[3]。兔抗大鼠Cdk5多克隆抗体(批号：Ab28441) 购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(批号：20121011) 购自武汉博士德生物技术有限公司；超纯RNA提取试剂盒(批号：CW0597)、UltraSYBR Mixture(With high ROX)(批号：CW2329A)、RNaseⅠ(批号：CW2090A)购自北京康为世纪生物科技有限公司；First Strand cDNA Synthesis Kit(批号：K1622)、蛋白预染Marker(批号：SM1811) 购自Fermentas公司；RIPA组织细胞快速裂解液(批号：BYL4082) 购自上海基尔顿生物；兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体(批号：5174) 购自上海拜力生物科技有限公司。
1.2 实验动物SPF级SD大鼠，♂，体质量250~280 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。
1.3 仪器BX51光学显微镜、IPP6.0图像分析系统由日本Olympus公司提供；Finesse 325石蜡切片机由英国Shando公司提供；手握式电动匀浆机由德国FLUKO公司提供；7300 Real-time PCR检测仪由美国ABI公司提供；电泳仪(mini protean 3 cell)由美国BIO-RAD公司提供。
2 方法 2.1 MCAO动物模型的制备及评价依据文献[7]，采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血大鼠模型。SD大鼠麻醉后，通过手术将鱼线插入颈内动脉，插入深度由分叉部计为(17.5±0.5) mm。假手术组仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉后即缝合。术后SPF级饲养，自由饮水、进食。动物于清醒后2 h参照Longa等[8]的5分制法进行神经功能评分，分值在1~3分者纳入实验范围。
2.2 分组及给药将SD大鼠分成假手术组和MCAO手术组，再将造模成功后的大鼠随机分为模型组、补阳还五汤干预组和补阳还五汤精简方干预组，每组50只，按5个时间点分别于给药后1、3、7、14、28 d处死，每个时间点10只。药物干预组于术后2 h给药，补阳还五汤组按成人等效剂量3.15 g·kg-1·d-1、补阳还五汤精简方组按前期实验[2]以2.41 g·kg-1·d-1药液灌胃，给药体积均为4.0 mL·kg-1。模型组和假手术组均给予等体积生理盐水。
2.3 免疫组化法检测大鼠海马组织CA1、CA2、CA3及齿状回区Cdk5的阳性表达各组大鼠分别于给药后各时间点随机挑出5只，心脏灌注法固定大脑后，取海马石蜡包埋切片于防脱玻片上。将烘干后的切片逐步脱蜡和水化后进行抗原修复，并用羊血清于37℃温箱中封闭30 min。取出切片加一抗，空白对照组加PBS，置于湿盒内，于4℃冰箱中孵育过夜，再加入二抗37 ℃温箱孵育30 min。显色复染后脱水，封片，晾干，于显微镜下观察。分别拍摄各组大鼠海马组织CA1区、CA2区、CA3区和齿状回区，×400倍视野下观察Cdk5表达情况，并采用Image pro-plus 6.0软件对阳性表达细胞(棕色)进行平均光密度统计。
2.4 Western blot检测海马组织中Cdk5蛋白的表达将各组大鼠海马组织裂解后，取上清进行蛋白质定量，取蛋白样品25 μg变性后进行SDS-PAGE电泳分离，湿转至PVDF膜上，封闭后与兔抗大鼠Cdk5多克隆抗体(1 :1 000)、兔抗大鼠GAPDH抗体(1 :1 500)4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，随后根据用量，与HRP标记的二抗(1 :1 000)37℃孵育1 h。将膜进行扫描，图像分析软件测定目的条带的积分光密度值(IOD)，以GAPDH为内参照，以目的条带IOD值与GAPDH条带IOD值的比值作为该蛋白的相对表达量。
2.5 RT-PCR法检测海马组织中Cdk5 mRNA的表达各组大鼠麻醉后断头取脑，迅速分离出海马，匀浆后采用RNA提取试剂盒提取组织RNA，逆转录合成cDNA，然后按反应程序37℃，60 min；85℃，5 min；4℃，5 min用特定Cdk5引物(236 bp，GC 59%，F：5′-ATCCCAGTCCGCTGCTACTC-3′；R：5′-GTCATGGCAGGCCACTGTTC-3′)和GAPDH引物(181 bp，GC 51%，F：5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′；R：5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′)进行各目的基因的反转录；将制备好的cDNA进行PCR扩增，反应程序为：95℃，10 min(95℃，15 s；60℃，45 s)×40；95℃, 15 s；60℃, 1 min；95℃, 15 s；60℃, 15 s。RT-PCR数据采用ABI Prism 7300 SDS Software分析，结果采用2-ΔΔCt[9]计算目的基因的相对表达量。
2.6 统计学分析采用SPSS 17.0进行统计学分析。所有实验数据均经过方差齐性检验和正态性检验，计量资料用x±s表示。相同时间点的比较采用独立样本t检验或方差分析。
3 结果 3.1 补阳还五汤精简方对MCAO模型大鼠海马组织不同分区Cdk5表达的影响给药7 d后，各组大鼠海马组织中Cdk5的表达情况见Fig 1。假手术组中Cdk5的表达较少，其中CA3区较其他海马亚区稍多，图中可见少量棕色颗粒；模型组大鼠脑缺血后海马组织星形胶质细胞增多，Cdk5蛋白表达的阳性细胞增加，在海马组织的4个区域均有较多表达(Fig 2结果表明与假手术组比较P < 0.01)，密集分布，主要集中在胞质表达，胞核仅少量表达，呈棕红色染，提示脑缺血能激活Cdk5，上调其表达水平；补阳还五汤及其精简方干预组中，Cdk5在CA1和CA3区胞质的表达虽较假手术组增多，但较模型组却明显减少。从脑缺血的时间进程上来看(Fig 2)，Cdk5在MCAO模型大鼠海马组织中CA1、CA2、CA3和齿状回4个区的表达在局灶性缺血后3~7 d达到高峰，随后则出现一定程度的下降趋势；采用补阳还五汤及其精简方干预3 d后，Cdk5的表达较同时间模型组比明显下调(P < 0.05)，且随着给药天数的增多，与假手术组的差异逐渐缩小，其中，Cdk5在CA2区和齿状回区的表达在给药28 d后与假手术组持平；而CA3区在给药14 d后，Cdk5即降至假手术组水平，提示补阳还五汤及其精简方能有效调控局灶性脑缺血模型大鼠海马组织中Cdk5的表达，且随着干预时间的延长，其调控效果越明显。
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| Fig 1 Expression Cdk5 in various areas of rat hippocampus after intragastrical administration 7 days(×400) A~D: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA1; E~H: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA2; I~L: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in CA3; M~P: Model, sham, Buyang Huanwu decoction and thin recipe of Buyang Huanwu decoction in dentate gyrus area |
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| Fig 2 Expression of Cdk5 in various areas of rat hippocampus at different time points(x±s, n=5) A: CA1 area; B: CA2 area; C: CA3 area; D: Dentate gyrus area.##P < 0.01 vs sham at same time; *P < 0.05 vs model at same time |
将Cdk5 mRNA在大鼠海马组织中的表达半定量后分析作图，结果见Fig 3。Cdk5 mRNA在MCAO模型组大鼠海马组织中的表达较假手术组比明显增加，随后则出现下降趋势，在造模7 d后达到最高水平，两组mRNA表达量比较差异具有显著性(P < 0.01)；同时间点药物干预组与模型组比差异亦有统计学意义(P < 0.05)，且药物干预至28 d后，Cdk5 mRNA的表达量基本降至假手术组水平。结果提示大脑局灶脑缺血损伤将导致Cdk5的异常表达，补阳还五汤精简方能一定程度降低Cdk5 mRNA在MCAO模型组大鼠海马组织中的表达水平。
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| Fig 3 Expression of Cdk5 mRNA in rat hippocampus at different time points(x±s, n=5) ##P < 0.01 vs sham at same time; *P < 0.05 vs model at same time |
Western blot结果见Fig 4、5。Cdk5蛋白在模型组中的所有时间点均呈大量表达，电泳条带宽且色深，与同时间点的假手术组比差异具有显著性(P < 0.01)，其中7~14 d，Cdk5的表达量达到最大值，到28 d，则呈现下降趋势；补阳还五汤及其精简方干预后，Cdk5的表达量较模型组明显下降(P < 0.05)，在给药28 d后，Cdk5的表达水平与假手术组持平，提示补阳还五汤精简方能一定程度降低MCAO模型大鼠海马组织中Cdk5蛋白的表达，防止其异常活化，进一步验证了补阳还五汤精简方可能通过Cdk5信号通路对脑缺血损伤发挥功效。
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| Fig 4 Expression of Cdk5 protein in rat hippocampus at different time points 1~4:Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 1);5~8:Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 3);9~12:Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 7);13~16:Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 14);17~20:Sham, model, Buyang Huanwu decoction, thin recipe of Buyang Huanwu decoction(day 28) |
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| Fig 5 Expression of Cdk5 protein in rat hippocampus at different time points(x±s, n=5) ##P < 0.01 vs sham at same time; *P < 0.05 vs model at same time |
脑缺血后，谷氨酸介导的兴奋性毒性使钙离子流过度积累，从而激活与Cdk5过表达密切相关的钙蛋白酶，并最终导致海马神经元死亡和认知障碍，提示Cdk5可能是脑缺血后海马神经细胞功能性的修复的关键作用位点。最新研究表明[10-11]，采用Cdk5抑制剂能降低局灶性缺血新生大鼠中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3) 的表达、成年缺血性中风大鼠模型中的细胞凋亡率，证实了Cdk5可以在细胞凋亡信号转导途径的上游进行调控。此外，研究[12-13]还表明，随着脑缺血的加剧，神经元死亡的延后导致内源性Cdk抑制剂的逐渐缺失，随之周期素依赖性激酶D1(cyclin D1) 上调，Cdk家族蛋白被激活，最终导致细胞骨架分解，进一步证实了Cdk5功能性缺陷是中风后神经元死亡的关键因素。本研究从脑缺血时间进程上动态研究大鼠海马组织Cdk5的表达情况，结果表明：随着脑缺血的进程，Cdk5蛋白及mRNA在MCAO模型大鼠海马组织中的表达呈现出先增加再缓慢降低的趋势，其表达量大概在缺血后7~14 d达到高峰，提示神经元可能存在一定的自我修复能力，但还不足以逆转神经元损伤；模型组Cdk5的表达量与同时间点的假手术组比差异具有显著性(P < 0.01)，且Cdk5在海马组织表达的定位主要集中在齿状回，CA1、CA2及CA3区亦有高表达，提示脑缺血可能激活Cdk5信号通路，与文献报道一致[14]。结合前期对周期蛋白Cdk4/cyclin D1的研究，提示脑缺后细胞周期蛋白的紊乱可能与神经细胞凋亡的上游调控蛋白Cdk5具有一定的相关性，这将是我们后续深入研究的方向。
秉承对传统中医药的继承和创新精神，结合方剂学“整体取性原理”和“君药不可缺少”的理论，补阳还五汤精简方选取原方中的黄芪入药，不仅大补元气，且能行气，利营卫之气，通营卫之阻滞以活血；辅以川芎行气活血，气行则血行，血行则瘀去脉通也，使气血和顺；地龙长于行散走窜，通经活络，为佐药。三药合用即为补阳还五汤类方，意即通过“祛瘀”、“化旧”或“去腐”等方法来祛除体内沉积的痰血及其他陈旧性的病理产物。此外，为更好发挥中药复方的整体功效，减少传统汤剂在煎煮过程中一些有效成分的丢失，补阳还五汤精简方采用现代中药制备工艺，将超临界二氧化碳萃取法和醇提、水煎工艺相结合，保证中药有效成分最大限度的溶出，且课题组前期通过拆方实验对补阳还五汤类方的配伍和剂量进行了优选[15]，最终确定以黄芪、川芎和地龙按10 :3 :1的比例组方，一定程度验证补阳还五汤类方的科学合理性。本研究结果表明，脑缺血后不同时间点，补阳还五汤精简方均能一定程度降低Cdk5的异常表达，采用补阳还五汤及其精简方干预3 d后，Cdk5的表达较同时间模型组比明显下调(P < 0.05)，且随着干预时间的延长，Cdk5的表达逐渐接近假手术组，干预28 d时，补阳还五汤精简方干预组与假手术组比差异无统计学意义，其效果与补阳还五汤原方组相当，从分子层面进一步验证了补阳还五汤精简方科学配伍的合理性和有效性。鉴于补阳还五汤精简方对调控Cdk5蛋白表达水平的有效性，有必要对其作用机制和活性成分进行更深层次研究，以期在此基础上将其开发成Cdk抑制剂。
( 致谢: 本文所有实验均完成于湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，实验过程中得到该实验室全体老师的指导及同学的协助，在此表示感谢！)
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