2. 汕头大学医学院 第一附属医院药剂科，广东 汕头 515041
2. Dept of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou, Guangdong 515041, China
心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤是临床常见的病理现象，是指心肌在缺血的基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆损伤的现象。I/R损伤主要表现在生物膜损伤、细胞器功能改变、炎症发生和细胞凋亡发生等[1-2]。钙非依赖磷脂酶A2(iPLA2)是磷脂酶A2(PLA2)家族的一大亚族，其发挥催化活性不需要钙离子的参与，可以水解膜磷脂，生成花生四烯酸(AA)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)[3]。AA和LPC作为细胞内信号分子，涉及广泛的生理病理效应，主要包括类花生四烯酸的产生、葡萄糖诱导胰岛素分泌、Fas诱导的细胞凋亡、细胞增殖、细胞膜代谢融合等，这些都与心肌缺血有密切关系[4-5]。AA作为iPLA2的主要产物之一，也是生成众多炎症因子的一个关键因子，能激发下游瀑布式的炎症反应。
钙拮抗剂(calcium antagonists)，也叫钙通道阻滞剂(calcium channel blockers，CCB)，主要通过阻断心肌和血管平滑肌细胞膜上的L-型钙离子通道，抑制细胞外钙离子内流，使细胞内钙离子水平降低而改善心血管等组织器官功能[6]。碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide, F2)是我们实验室在氟哌啶醇(haloperidol, Hal)的基础上改造合成的一种具有心血管活性的新型钙拮抗剂，通过阻断心肌细胞膜钙通道而拮抗心I/R损伤[7]。本实验室前期研究表明，F2无论是对整体的I/R损伤，还是对离体的心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)损伤均有保护作用，其作用机制可能与阻断心肌细胞细胞膜上L-型钙通道(L-VDCC)，拮抗心肌细胞钙超载，抑制早期生长反应基因-1(early growth response gene-1, Egr-1) 过表达有关[8-10]。实验室前期研究表明，心肌细胞转染iPLA2质粒使iPLA2高表达后，H/R损伤加重；转染iPLA2-siRNA沉默iPLA2基因，H/R损伤减轻，验证了iPLA2参与心肌细胞H/R损伤[11]。而关于iPLA2能否作为钙拮抗剂的作用靶点介导细胞抗H/R损伤，成为钙拮抗剂抗心肌I/R损伤的另一个机制，未有文献报道。故本研究拟采用I/R损伤中最先受累且参与调控I/R病理生理进程的心脏微血管内皮细胞(CMECs)制备H/R模型[12]，选取3种经典钙拮抗剂硝苯地平(Nif)、地尔硫(Dil)、维拉帕米(Ver)及F2，探讨其调节iPLA2抗H/R损伤的保护作用及机制。
1 材料与方法 1.1 材料新生(1~4 d)SD乳鼠(汕头大学医学院实验动物中心)♀♂不限。胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培养基(Gibco公司，美国)；肝素钠注射液(成都市海通药业有限公司，中国)；内皮细胞生长添加剂(ECGS)(Merk Millipore公司，德国)；青霉素-链霉素溶液(Biosharp公司，中国)；iPLA2兔多克隆抗体(Proteintech，美国)；β-actin小鼠单克隆抗体、HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记羊抗小鼠IgG(武汉博士德生物工程有限公司，中国)；TRIzol、PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time、SYBRPrem ExTaqII(TaKaRa公司，日本)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成生物研究所，中国)；白介素-6(IL-6) ELISA试剂盒(Ebioscience公司，美国)；花生四烯酸(AA) ELISA试剂盒(Cusabio公司，中国)；DeadEndTM Flourumetric TUNEL System(Promega公司，美国)；盐酸维拉帕米(Ver)注射液(上海禾丰制药有限公司，中国)；硝苯地平(Nif)、地尔硫(Dil)(Sigma公司，美国)；F2由汕头大学医学院药物研究室化学组合成，实验前用DMSO配成所需浓度；其他试剂均为国产分析纯。SW-CJ-1F超净工作台(苏州净化设备有限公司，中国)；CO2培养箱(Sanyo公司，日本)；倒置相差显微镜(Nilkon公司，日本)；PB-10 pH酸度计(Sarotorius公司，德国)；低温高速离心机(Heraeus公司，德国)；SpectraMax M2多功能酶标仪(Molecular Devices公司，美国)；Olympus BX53正置荧光显微镜(Olympus公司，日本)；ABI 7500实时荧光定量仪(ABI公司，美国)；Invivo 2400低氧/厌氧工作站(Ruskinn公司，英国)；Gel-pro图像分析软件(Media cybernetics, USA)。
1.2 原代CMECs培养将出生1~4 d的SD乳鼠经75%酒精消毒，仰卧，四肢固定(以下步骤均为无菌操作)。开胸，剥离心脏，取心脏下端1/3心室肌部分，置于预冷(4℃)PBS中充分清洗，用眼科剪将心肌组织剪成1 mm×1 mm×1 mm组织块，加入10倍体积的0.1%胰蛋白酶，37℃消化5 min，轻轻吹打，静置1 min，吸取上清液，余下组织块加入0.1%胰蛋白酶消化5 min，收集上清液。将2次收集的上清液合并，加入含10%FBS的DMEM完全培养基灭活胰酶终止消化，1 000 r·min-1，4℃离心10 min，弃上清，收集细胞。加入含10%FBS的DMEM完全培养基(含有100 kU·L-1青霉素、100 kU·L-1链霉素、6 250 U·L-1肝素钠、15 mg·L-1 ECGS)，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养6 h，6 h后，更换培养基去除未贴壁细胞。CO2恒温培养箱培养，24 h后更换培养基，以后每2 d换液1次，至CMECs融合成单层，当细胞长至85%~90%可进行消化传代培养。采用3~8代CMECs进行实验。
1.3 实验分组及H/R模型建立将CMECs随机分为对照(Control，简称Ctrl)组、H/R组、H/R+溶剂(DMSO)组、H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组、H/R+Nif(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组、H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组。Ctrl组于实验前更换为0.5%FBS DMEM培养基(复氧液)，按正常培养条件培养4.5 h。其余各组制备缺氧模型，均更换为高纯度氮气饱和30 min的缺氧液，放入低氧/厌氧工作站中培养4 h。缺氧完成后，更换复氧液，放入CO2恒温培养箱培养0.5 h，造成CMECs H/R损伤。
1.4 CMECs上清液中LDH活性测定将CMECs接种于24孔板中，待细胞融合率达到85%~90%，按上述分组。复氧结束后，收集细胞上清复氧液，按LDH试剂盒说明书操作，比色法测定LDH活性。
1.5 酶联免疫吸附法测定IL-6和AA浓度将CMECs接种于24孔板中，待融合率达到85%~90%时制备H/R模型。收集细胞上清复氧液，按ELISA试剂盒说明书操作，于450 nm波长处检测各组吸光值，并拟合标准曲线，代入各组OD值，计算各组IL-6和AA浓度。
1.6 荧光显微镜观测细胞凋亡水平首先将75%乙醇消毒过的盖玻片紫外灭菌30 min后放入24孔板中，接种CMECs，爬片成功后，根据实验要求分组处理。预冷PBS洗涤3次，将盖玻片浸没在4%甲醛溶液(溶于1×PBS)中固定，室温孵育15 min。去掉多余液体，每孔加入500 μL 0.3% TritonX-100，室温孵育15 min。在1×TBS溶液中浸没清洗样本3次，轻轻去掉多余液体。滴加100 μL 1×TdT平衡缓冲液(蒸馏水稀释)，使其全部覆盖样本，室温孵育10 min。吸干样本周围的平衡缓冲液，立即滴加50 μL TdT标记反应混合物(平衡缓冲液:核苷混合物:rTDT=45 :5 :1)。用Paraflim®封口膜覆盖样本，置于湿盒中37℃避光孵育60 min。移走封口膜，并将盖玻片置于1×TBS溶液中室温孵育1 min。去掉多余液体，换用新鲜的1×TBS溶液室温孵育1 min，重复1次。用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的TBS溶液。逐滴滴加Mounting Media封片剂并盖上盖玻片。荧光显微镜下观察，使用DAPI的滤光片观察样本中的全体细胞，使用标准的绿色荧光滤光片观察凋亡的细胞。
1.7 Real time-PCR检测iPLA2 mRNA表达将CMECs接种于24孔板中，待细胞融合率达到85%~90%，按上述分组。采用TRIzol一步法提取细胞总RNA，Nano2000测其RNA浓度。用RT逆转录试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA为模板，通过Real time-PCR检测iPLA2的表达。以β-actin为内参，计算2-ΔΔCT值。
1.8 Western blot检测iPLA2蛋白表达CMECs接种至直径7 cm的培养皿中，待铺满皿底，给予相应处理后，每皿加70 μL裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-1、4℃离心收集上清液。BCA法蛋白定量。将蛋白样本进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜法将蛋白转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4℃孵育过夜；二抗37℃孵育1 h，ECL化学发光，暗室曝光。Gel-pro图像分析软件分析蛋白条带的灰度值。
1.9 统计学处理采用GraphPad Prism 5软件统计分析，结果以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和t检验。
2 结果 2.1 钙拮抗剂对CMECs H/R后LDH漏出的影响如Fig 1所示，与Ctrl组相比，H/R组与H/R+DMSO组LDH漏出量明显增加(P < 0.05)；与H/R+DMSO组相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组、H/R+Nif(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组均能量效依赖性地减少LDH漏出量，差异具有统计学意义(P < 0.05)；而H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组与H/R+DMSO组相比，有剂量依赖减少LDH漏出量的趋势，但差异无统计学意义。
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| 图 1 Effect of calcium antagonists on LDH induced by H/R(x±s，n=5) 1:Ctrl; 2:H/R; 3:H/R+DMSO; 4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1); 5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1); 6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1); 7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1); 8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1); 9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1); 10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1); 11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1); 12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1); 13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1); 14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1); 15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P < 0.05 vs Ctrl; #P < 0.05 vs H/R+DMSO |
如Fig 2所示，与Ctrl组相比，H/R组与H/R+DMSO组IL-6浓度明显增加(P < 0.05)；与H/R+DMSO相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组均能量效-依赖性地降低IL-6浓度，H/R+Nif(10.0、1.0 μmol·L-1)组能明显降低IL-6浓度，差异具有统计学意义(P < 0.05)，且呈量效-依赖性；而H/R+Nif(0.1 μmol·L-1)组和H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组与H/R+DMSO组相比，IL-6浓度差异没有显著性。
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| Fig 2 Effect of calcium antagonists on IL-6 induced by H/R(x±s, n=5) 1:Ctrl; 2:H/R; 3:H/R+DMSO; 4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1); 5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1); 6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1); 7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1); 8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1); 9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1); 10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1); 11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1); 12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1); 13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1); 14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1); 15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P < 0.05 vs Ctrl; #P < 0.05 vs H/R+DMSO |
如Fig 3所示，与Ctrl组相比，H/R组与H/R+DMSO组细胞凋亡明显增加(P < 0.05)；与H/R+DMSO组相比，H/R+F2(1.0 μmol·L-1)组、H/R+ Ver(1.0 μmol·L-1)组、H/R+Nif(1.0 μmol·L-1)组均能减少细胞凋亡，差异具有统计学意义(P < 0.05)；而H/R+Dil(1.0 μmol·L-1)组与H/R+DMSO组相比，未发现细胞凋亡减少，两组间差异无统计学意义。
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| 图 3 Effect of calcium antagonists on apoptosis induced by H/R(x±s，n=3) 1:Ctrl; 2:H/R; 3:H/R+DMSO; 4:H/R+F2(1.0 μmol·L-1); 5:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1); 6:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1); 7:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1).*P < 0.05 vs Ctrl; #P < 0.05 vs H/R+DMSO |
如Fig 4、5所示，与Ctrl组相比，H/R组与H/R+DMSO组iPLA2表达明显增高(P < 0.05)；与H/R+DMSO组相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组和H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组均能量效依赖性地降低iPLA2mRNA和蛋白表达，差异具有统计学意义(P < 0.05)；而H/R+Nif(10、1.0、0.1 μmol·L-1)和H/R+Dil(10、1.0、0.1 μmol·L-1)组与H/R+DMSO组相比，未发现iPLA2 mRNA和蛋白表达的降低，两组间无统计学差异。
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| Fig 4 Effect of calcium antagonists on expression of iPLA2 mRNA(x±s, n=9) 1:Ctrl; 2:H/R; 3:H/R+DMSO; 4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1); 5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1); 6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1); 7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1); 8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1); 9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1); 10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1); 11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1); 12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1); 13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1); 14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1); 15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P < 0.05 vs Ctrl; #P < 0.05 vs H/R+DMSO |
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| Fig 5 Effect of calcium antagonists on expression of iPLA2 protein(x±s, n=3) *P < 0.05 vs Ctrl; #P < 0.05 vs H/R+DMSO |
如Fig 6所示，与Ctrl组相比，H/R组与H/R+DMSO组AA浓度明显增加(P < 0.05)；与H/R+DMSO组相比，H/R+F2(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组、H/R+Ver(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组均能量效依赖性地降低AA浓度，H/R+Nif(10.0、1.0 μmol·L-1)组能明显降低AA浓度，差异具有统计学意义(P < 0.05)；而H/R+Nif(0.1 μmol·L-1)组和H/R+Dil(10.0、1.0、0.1 μmol·L-1)组与H/R+DMSO组相比，AA浓度没有统计学差异。
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| Fig 6 Effect of calcium antagonists on AA induced by H/R(x±s, n=5) 1:Ctrl; 2:H/R; 3:H/R+DMSO; 4:H/R+F2(10.0 μmol·L-1); 5:H/R+F2(1.0 μmol·L-1); 6:H/R+F2(0.1 μmol·L-1); 7:H/R+Ver(10.0 μmol·L-1); 8:H/R+Ver(1.0 μmol·L-1); 9:H/R+Ver(0.1 μmol·L-1); 10:H/R+Nif(10.0 μmol·L-1); 11:H/R+Nif(1.0 μmol·L-1); 12:H/R+Nif(0.1 μmol·L-1); 13:H/R+Dil(10.0 μmol·L-1); 14:H/R+Dil(1.0 μmol·L-1); 15:H/R+Dil(0.1 μmol·L-1).*P < 0.05 vs Ctrl; #P < 0.05 vs H/R+DMSO |
心肌I/R损伤是一个复杂的多因素参与的病理过程，损伤的发生机制包括氧自由基产生、钙超载、白细胞趋化作用、能量代谢障碍和炎症反应等[1-2, 13]。缺血前或早期给予钙拮抗剂可以通过对细胞膜L-VDCC的阻断作用，减少胞内的钙离子，减轻细胞内钙超载，减少心肌的不可逆损伤。然而，近年来有学者认为，钙拮抗剂也可能通过作用其它环节而发挥效应，且多年来对于钙拮抗剂减轻I/R损伤的机制报道也并非一致[14-16]。有人认为是通过其负性肌力和负性频率作用，节省能量，改善I/R损伤；也有报道钙拮抗剂具有抗氧自由基和调节NO合酶的作用[17-18]。
研究表明，炎性反应血管高通透性被认为是心肌I/R损伤的中心环节，此过程中内皮细胞功能紊乱是I/R损伤发生的始动环节。内皮细胞缺氧损伤后促进炎症因子的释放，进而引起白细胞聚集、黏附、血管收缩、血栓形成及内皮细胞肿胀造成无复流现象，加重H/R损伤[12]，再灌注前给予保护内皮功能的药物可对抗内皮细胞功能紊乱，减少心肌损伤。iPLA2作为磷脂酶超家族的一员，文献报道其在心肌中有相对高的活性。心肌膜由磷脂双分子层构成，能调节细胞生长、信号转导和运输功能。心肌缺血时，心肌膜破损，导致细胞功能紊乱，进一步加重心肌损伤，iPLA2在细胞膜磷脂的维持和修复程度中发挥关键作用。iPLA2对于心肌I/R的病理发展也具有重要的作用，其水解膜磷脂生成AA和LPC产物，两个产物具有多样性的生物效应，介导不同信号通路产生有害反应，参与了一系列炎症、凋亡等反应，从离子通道的调节到对多种信号通路的作用，尤其是在心肌I/R损伤中发挥重要作用。实验室前期研究表明iPLA2参与心肌细胞H/R损伤[11]，心肌I/R或细胞H/R情况下，iPLA2高表达，活性增加，所生成的AA和LPC引起细胞损伤，钙拮抗剂对iPLA2这样一个重要的“上游”酶类的调节发挥多方面的效应。钙拮抗剂通过抑制iPLA2高表达，主要是通过对产物AA的产生发挥作用，通过降低心肌I/R情况下AA的产生，从而抑制AA所激发的下游瀑布式炎症效应，保护心肌损伤。基于此，许多学者认为iPLA2很可能成为诸多疾病的药物作用靶点。本实验在前期工作的基础上，探讨在细胞H/R情况下，钙拮抗剂是否通过调控iPLA2异常表达产生抗损伤作用。
本实验结果提示，0.1~10.0 μmol·L-1的钙拮抗剂F2、Ver及Nif具有抗H/R损伤、保护CMECs的作用，且F2和Ver是通过抑制iPLA2高表达抗H/R损伤的，Nif对iPLA2高表达无作用。Hempel等[19]发现，在无L-VDCC的内皮细胞上，Nif可通过直接抑制PKC转位，减少缺血引起的内皮细胞通透性增加，降低内皮细胞的通透性，从而保护内皮细胞缺血损伤。这些研究都表明[11, 19]，钙拮抗剂除了能阻断钙通道外，还可能存在非钙通道阻断途径(如非L-VDCC依赖机制)。至于Dil与其他3种钙拮抗剂的不同作用，仍需进一步探讨。结果表明，F2和Ver量效依赖地降低了iPLA2的表达，提示iPLA2可能是钙拮抗剂F2和Ver抗H/R损伤新的作用靶点，为其临床应用提供了科学依据。
( 致谢: 本文实验是在汕头大学医学院药理学教研室完成，感谢在实验过程中给予建议与帮助的老师和同学。)
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