阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是多发于65岁以上人群的神经系统退行性疾病，临床表现为进行性的记忆损伤、认知障碍以及精神行为异常。β-淀粉样蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)沉积形成的老年斑和细胞微管连接蛋白tau的高度磷酸化产生的神经纤维缠结是AD的两大病理特征[1]。Aβ异常产生与沉积可引起tau蛋白磷酸化、递质丢失、神经胶质增生和炎症等复杂的级联反应，引发了神经纤维缠结、神经元丢失和脑组织萎缩等AD病理现象[2-3]。目前治疗AD的药物，如多奈哌齐、加兰他敏等，主要通过调节兴奋性神经递质通路而改善轻、中度AD症状，但不能预防、终止或逆转AD进程，且伴有呕吐、腹泻等胃肠道不良反应[4-6]。因此，研发疗效确切、安全无毒的AD防治药物迫在眉睫。
蛇床子素(osthole，Ost)，又名甲基欧芹酚或欧芹酚甲醚，是中药独活的主要活性成分。研究表明，蛇床子素具有改善学习记忆、延缓衰老、抗肿瘤等药理活性[7]。近年来本实验组发现，蛇床子素能改善AD模型细胞损伤[8-9]，维持AD神经元突触的结构和功能[10]，并能够促进AD神经干细胞向多种神经细胞分化[11-12]，提示蛇床子素有可能成为治疗AD的潜在开发药物。但蛇床子素对Aβ的影响及机制尚不明确，故本实验采用APP595/596基因感染小鼠神经元，构建AD细胞模型，探讨蛇床子素是否通过上调miRNA-107，抑制将淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)剪切成Aβ的β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme 1，BACE1) 的表达，进而减少Aβ的生成，发挥对AD细胞的保护作用。
1 材料 1.1 药品与试剂蛇床子素，购自中国药品生物制品检定所(纯度≥98.0%，批号：110822-200305)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液和青霉素-链霉素均购自Gibco；APP595/596质粒、绿色荧光蛋白(green fluorescein protein，GFP)质粒及慢病毒包装系统(pLP1、pLP2、pLP/VSV-G)由天津医科大学闫亚平教授构建；脂质体2000(Invitrogen公司)；DH5α感受态大肠杆菌、无内毒素质粒小提试剂盒(Omega公司)；CCK-8试剂盒(Dojindo公司)；二甲基亚砜(Amresco公司)；乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)试剂盒(南京建成公司)；cDNA合成试剂盒和PCR Master Mix试剂，购自Fermentas；兔抗人NF-M、APP、Aβ1-42、BACE1一抗(Bioss公司)；二抗Cy3标记羊抗兔免疫球蛋白G(Jackson公司)。
1.2 仪器与设备Ti-S型荧光显微镜(日本尼康)、DIV-86L386超低温冰箱(青岛海尔)、CO2培养箱(NUAIRE，BPN)、酶标仪(深圳迈瑞，MR-96A)、PCR仪(杭州朗基，MG96G)、凝胶成像系统(UVP，GeneGenius)。
1.3 动物SPF级C57BL/6小鼠，购自辽宁长生生物有限公司，许可证号：SCXK(辽)2015-0001。出生48 h内的新生小鼠用于实验。
2 方法 2.1 蛇床子素溶液的配制精密称取2.31 mg Ost，溶于50 μL DMSO中，加DMEM稀释至1 mL, 制成浓度为10 mmol·L-1的Ost母液，加DMEM稀释至终浓度为50 μmol·L-1的Ost工作液，-20℃冻存备用。
2.2 小鼠皮层神经元的分离与培养取新生小鼠大脑皮层，剪成糜状，胰酶消化15 min，筛网过滤得到细胞悬液，以6×108·L-1的密度接种于96孔板(经多聚赖氨酸包被过)，加入DMEM完全培养基，5% CO2培养箱中培养。接种d 3，培养基替换为含有2.5 μmol·L-1阿糖胞苷的DMEM完全培养基，48 h后更换新的完全培养基。待细胞融合度达70%~80%以上，用于转染实验。
2.3 APP595/596转染神经元构建AD细胞模型GFP-APP595/596质粒转化DH5α感受态大肠杆菌，接种于LB固体培养基，37℃倒置培养16 h，挑取阳性克隆，置于LB液体培养基中，37℃振荡培养18 h，提取GFP-APP595/596质粒。取GFP或GFP-APP595/596质粒15 μg、pLP1质粒6.5 μg、pLP2质粒2.5 μg、pLP/VSV-G质粒3.5 μg，采用脂质体2000介导转染293T细胞，空白对照组转染GFP质粒。培养24 h后，荧光显微镜下观察，呈现绿色荧光。转染72 h后，分别收集含有病毒的细胞培养液上清，离心，浓缩，检测病毒滴度；浓缩的病毒上清转染神经元，72 h后，采用免疫荧光化学法检测转染情况，RT-PCR检测APP的mRNA表达，Western blot检测APP的蛋白表达。
2.4 实验分组实验分为正常对照组(转染GFP的神经元，GFP)、模型对照组(转染GFP-APP595/596基因的神经元，APP)和Ost干预组(转染GFP-APP595/596基因的神经元，Ost)。Ost组给予蛇床子素(终浓度为50 μmol·L-1)，GFP组和APP组给予等量溶媒，作用24 h后，检测下列指标。
2.5 CCK-8法检测神经元活力各组细胞药物干预24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育4 h后，450 nm下检测吸光度。
2.6 试剂盒法检测神经元LDH释放量各组细胞药物干预24 h后，离心取上清液，根据试剂盒说明书操作，510 nm下检测各组吸光度，计算LDH的释放量。
2.7 TUNEL染色法检测神经元凋亡按照TUNEL试剂盒说明书进行操作。各组细胞药物干预24 h后，以1%多聚甲醇固定30 min，0.2%的Triton X-100透化5 min，PBS冲洗，加入PE，37℃孵育1 h，用PBS洗净，DAPI避光染色5 min，置荧光显微镜下观察神经元凋亡情况。用Image J软件进行计数，计算凋亡率。凋亡率/%=红色凋亡细胞数/DAPI阳性细胞数×100%。
2.8 免疫荧光化学法检测Aβ和BACE1蛋白表达各组细胞进行药物干预24 h后，弃去上清液，以4%多聚甲醛固定30 min，0.1%的Triton X-100透化20 min，加入一抗稀释液(1 :100)，4℃过夜，再加入Cy3标记的二抗稀释液(1 :100) 室温避光1 h，用PBS洗净，加入DAPI避光孵育15 min，再洗净加入抗荧光淬灭剂进行封片，倒置荧光显微镜下观察，并用Image J软件对各组细胞中Aβ及BACE1蛋白的荧光强度进行扫描和定量。
2.9 RT-PCR法检测APP和miRNA-107基因表达试剂盒法提取各组细胞总RNA，按Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit所示比例配制成RT反应体系，65℃ 5 min；42℃ 60 min，70℃ 5 min，合成cDNA，-80℃冻存备用。进行PCR反应(50 μL体系)：按PCR Master Mix Kit所示比例配制成PCR反应体系，样品DNA用量为2.5 μL。反应条件为95℃ 2 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 10 min，35个循环后，进行琼脂糖凝胶电泳，Image J进行光密度扫描分析。各引物序列见Tab 1。
| Gene | Sequences of primers(5'-3') | Product/bp |
| APP | F:AAAACGAAGTTGAGCCTGTTGAT | 344 |
| R:GAACCTGGTCGAGTGGTCAGT | ||
| β-actin | F:TGCTGTCCCTGTATGCCTCT | 385 |
| R:TTTGATGTCACGCACGATTT | ||
| F：forward primer，R：reverse primer | ||
采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
3 结果 3.1 APP在转染APP595/596基因的神经元中高表达经免疫荧光法鉴别，培养的小鼠皮层神经元表达神经细胞标记物神经丝蛋白M(neurofilament M, NF-M)(Fig 1A)。转染APP595/596基因后，在荧光显微镜下观察GFP的表达情况。结果显示，感染了GFP-APP和感染了GFP的神经元都呈现绿色荧光(Fig 1A)。RT-PCR法与Western bolt结果显示，感染了GFP-APP的神经元中，APP呈现高表达(Fig 1B、1C)，证明稳定表达APP595/596的转基因神经元构建成功。
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| Fig 1 Highly expressed APP in neurons transfected with APP595/596 gene A:Immunocytochemistry staining. NF-M is short for neurofilament M, NF-M+(Red), GFP+(green); B: The mRNA of APP assessed by RT-PCR; B: The protein of APP assessed by Western blot |
如Fig 2所示，转染APP595/596的神经元存活率为(57.9±4.6)%，明显低于正常对照组(100±4.4)%(P < 0.01)，而给予Ost(终浓度50 μmol·L-1)后，神经元存活率升高至(79.5±3.6)%，与模型组(57.9±4.6)%比较，差异有显著性(P < 0.01)，提示Ost能提高APP595/596转基因神经细胞的存活率。
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| Fig 2 Ost developed viability of neuronstransfected with APP595/596 gene(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs GFP group; **P < 0.01 vs APP group |
如Fig 3所示，转染APP595/596的神经元LDH的释放量明显升高，与正常对照组比较，差异有显著性(P < 0.01)，给予50 μmol·L-1的Ost后，LDH水平与模型组比较明显降低(P < 0.01)。提示Ost可减少APP595/596转基因神经元的LDH释放量。
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| Fig 3 Ost decreased LDH release of neuronstransfected with APP595/596 gene(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs GFP group; **P < 0.01 vs APP group |
如Fig 4所示，转染APP595/596基因的神经元红色斑点明显多于正常对照组(P < 0.01)，说明模型组神经元发生了凋亡反应；给予Ost后，红色斑点减少，神经元凋亡率降低，与模型组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)。提示Ost能够抑制APP595/596转基因神经元的凋亡。
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| Fig 4 Ost inhibited apoptosis of neurons transfected with APP595/596 gene(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs GFP group; **P < 0.01 vs APP group |
如Fig 5所示，转染APP595/596基因的神经元Aβ的表达明显高于正常对照组(P < 0.01)；给予Ost后，Aβ的表达明显降低，与模型组比较，差异有显著性(P < 0.01)。提示Ost能够抑制Aβ的表达。
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| Fig 5 Ost reduced expression of Aβ inneurons transfected with APP595/596 gene(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs GFP group; **P < 0.01 vs APP group |
如Fig 6所示，转染GFP的对照组神经元BACE1的表达较弱，而转染APP595/596基因的模型组BACE1的表达明显增强(P < 0.01)；给予Ost后，BACE1的表达明显降低，与模型组比较差异有显著性(P < 0.01)。提示Ost能够抑制BACE1的表达。
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| Fig 6 Ost inhibited expression of BACE1 in neurons transfected with APP595/596 gene DAPI+(blue), BACE1+(red)(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs GFP group; **P < 0.01 vs APP group |
如Fig 7所示，模型组与对照组相比，miRNA-107的表达明显降低(P < 0.01)，给药组miRNA-107的表达明显升高，与模型组比较差异有显著性(P < 0.01)。提示Ost能够上调APP595/596转基因神经元中miRNA-107的表达。
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| Fig 7 Ost inhibited miRNA-107 inneurons transfected with APP595/596 gene(x±s, n=3) ##P < 0.01 vs GFP group; **P < 0.01 vs APP group |
AD的Aβ致病假说已被广泛接受，认为Aβ在脑组织中的积聚是各种原因诱发AD的共同通路，也是AD形成和发生的关键因素。研究发现，APP基因595/596位点发生突变，导致细胞及动物脑内具有神经毒性的Aβ分泌量明显升高，表现出与AD患者类似的病理和临床特征，如大脑内局限性Aβ沉积、行为障碍及痴呆症状出现的早晚与年龄相关等[13-15]。本实验采用APP595/596基因转染小鼠皮层神经元，在体外构建AD细胞模型，经RT-PCR及Western blot法鉴定，转基因神经细胞过表达APP595/596基因，说明AD细胞模型制备成功。
课题组前期实验[16]，考察了终浓度为10、50、100 μmol·L-1的Ost作用24 h，对过表达APP595/596的神经细胞的保护作用，发现50 μmol·L-1作用最佳。本实验选取50 μmol·L-1的Ost进行机制研究。结果显示，Ost能够明显提高神经元存活率，减少LDH的释放，并有效抑制神经元凋亡，说明Ost对转染APP595/596基因的神经元具有良好的保护作用。
BACE1是裂解APP产生Aβ的第一限速酶，AD患者大脑中BACE1的蛋白量和酶活力明显高于正常水平，通过抑制BACE1的活性，可以抑制APP水解生成Aβ，从而减少Aβ淀粉样斑块，改善损伤神经元突触的可塑性，提高学习记忆能力[17-18]。BACE1作为miRNA-107(一种内源性非编码RNA，能够通过靶基因的互补配对，抑制靶蛋白的表达)的靶基因之一，其mRNA的3'UTR区存在miRNA-107的结合位点，两者表达呈负相关[19]。研究表明，上调miRNA-107的表达能够减少Aβ斑块沉积，从而减少脑组织中神经纤维缠结[20]。为进一步研究Ost保护神经元的作用机制，作者分别采用免疫荧光化学法和RT-PCR法，检测转染APP595/596基因的小鼠神经元在给予Ost前后BACE1和miRNA-107的表达情况。实验结果显示，Ost明显降低BACE1的蛋白表达，升高miRNA-107的表达，说明Ost有可能通过提高miRNA-107表达来降低BACE1的蛋白表达，从而抑制了APP向Aβ水解，减少Aβ产生，进而改善细胞损伤，提高细胞活力，减少细胞凋亡和损伤，发挥保护神经细胞的作用。
( 致谢: 本实验是在辽宁中医药大学药学院杨静娴教授实验室完成，感谢教亚男、李少恒、王玉莹等同学的帮助！)
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