2. 河北省络病重点实验室，河北 石家庄 050035;
3. 河北以岭医药研究院, 河北 石家庄 050035;
4. 河北医科大学附属以岭医院内分泌科, 河北 石家庄 050091
2. Hebei Key Lab for Collateral Disease, Shijiazhuang 050035, China;
3. Hebei Yiling Medicine Research Institute, Shijiazhuang 050035, China;
4. Endocrinology of Yiling Hospital Affiliated of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050091, China
研究发现[1]，通心络联合外周血间充质干细胞移植可通过调节HIF-1/VEGF通路及miR-210表达来促进内皮细胞增殖、分化，进而促进新生血管形成。然而，局部恶劣的微环境，如缺血缺氧、炎症反应、氧化应激等，不利于心肌梗死区干细胞移植后的生存、分化，致使其疗效受限[2]。因此，本实验研究就通心络是否改善糖尿病足(dibetic foot, DF)大鼠缺血下肢外周血间充质干细胞移植炎症水平，以探讨其促进外周血间充质干细胞移植治疗血管新生效果的作用。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂通心络原粉、链脲佐菌素(STZ)、4、6-联脒-2-苯基吲哚来源及批号参照文献[1, 3]，IL-1、IL-6、TNF-α检测试剂盒(南京建成，批号20140526), ICAM-1 Mouse monoclonal antibody(ab171123, 英国Abcam公司)，VCAM-1 Rabbit monoclonal antibody(ab134047, 英国Abcam公司)。
1.2 仪器CTR6000荧光显微镜(德国Leica公司)，170-930型电转膜仪、165-8001型垂直电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
1.3 动物分组及给药SD大鼠，50只，体质量190~230 g[由中国食品药品检定研究院提供，合格证号SCX K(京)2009-0017]，参照文献[1]的造模方法，造模大鼠高脂[3]喂养8周，禁食16 h后腹腔注射STZ(35 mg·kg-1)，72 h后测尾尖血糖在16.7 mmol·L-1以上者入选为糖尿病模型。入模大鼠结扎并剪断股动脉和股静脉建立糖尿病足模型，并随机分为模型组(MD)、通心络组(TXL)、外周血间充质干细胞组(PB-MSCs)、通心络联合外周血间充质干细胞组(T-MSCs)，每组10只，以同批次正常大鼠复制下肢缺血模型为对照组(CN)、DM和PB-MSCs大鼠以等体积的生理盐水灌胃，TXL和T-MSCs给予通心络0.4 g·kg-1·d-1，灌胃4周；PB-MSCs和T-MSCs术后3 d肌肉注射给予干细胞移植1.0×109·L-1，CN、MD和TXL同点肌肉注射等体积无菌RPMI 1640培养基。
1.4 检测干细胞在体内存活肌肉组织冰冻切片，荧光显微镜下观察，采用Image-Pro Plus 5.0(IPP)图像处理分析软件方法分析。
1.5 各组大鼠血清炎性因子水平检测放射免疫分析技术检测IL-1、IL-6和TNF-α。
1.6 肌肉血管内皮因子相关蛋白表达检测根据参考文献[1]检测大鼠缺血下肢肌组织中ICAM-1、VCAM-1蛋白表达。
1.7 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件分析，数据均用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 干细胞移植后计数和积分光密度T-MSCs干细胞数和积分光密度多于PB-MSCs(P＜0.01)，Tab 1。
| Group | Number | IOD |
| PB-MSCs | 16±4 | 98.00±3.21 |
| T-MSCs | 27±4** | 135.3±3.90** |
| **P＜0.01 vs PB-MSCs group | ||
与CN比较，MD中IL-1、IL-6、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1表达均明显升高(P＜0.01)。与MD比较，PB-MSCs中表达无统计学意义(P＞0.05)；余用药组中表达均明显降低(P＜0.05，P＜0.01)。与PB-MSCs比较，T-MSCs血清IL-1、IL-6和TNF-α明显降低(P＜0.01)。见Tab 2~3。
| Group | IL-1/μg·L-1 | IL-6/ng·L-1 | TNF-α/μg·L-1 |
| CN | 0.26±0.02 | 1.52±0.19 | 97.41±16.14 |
| MD | 0.38±0.07** | 2.14±0.36** | 143.37±28.93** |
| TXL | 0.32±0.07# | 1.63±0.24# | 120.62±30.68## |
| PB-MSCs | 0.34±0.07 | 1.95±0.26 | 128.78±14.37 |
| T-MSCs | 0.28±0.05##△ | 1.61±0.20##△ | 109.95±11.92##△△ |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs Control group; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model group; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs PB-MSCs group | |||
| Group | ICAM-1 | VCAM-1 |
| CN | 0.22±0.06 | 0.36±0.01 |
| MD | 1.37±0.00** | 1.17±0.04** |
| TXL | 0.84±0.06# | 0.65±0.06# |
| PB-MSCs | 0.95±0.06 | 0.74±0.03 |
| T-MSCs | 0.53±0.04## | 0.44±0.02## |
| *P＜0.05, **P＜0.01 vs Control group; #P＜0.05, ##P＜0.01 vs model group | ||
近年来随着国内外研究发现炎症反应是血管内皮损伤的重要机制，在糖尿病足(dibetic foot, DF)的发生、发展中可能具有重要作用[4]。既往研究[5]发现，组织缺血缺氧、缺血/再灌注损伤时，引发大量炎性因子释放强烈的氧化应激反应等，导致缺血缺氧组织区域微环境恶劣，导致移植后的干细胞大量死亡，致使其疗效受限。实验结果说明通络药物可以减轻炎症刺激，提高干细胞移植后血管新生。因此推测中药通心络可能通过改善干细胞移植的局部微环境，促进干细胞移植后治疗性血管新生及侧支循环建立，改善缺血下肢血流灌注量，改善缺血血供。
(致谢: 本实验由河北以岭医药研究院、国家中医药管理局重点研究室指导，于河北省络病重点实验室完成，感谢以上科室对本实验提供的技术指导及资金支持。 )
| [1] | 郭勇英, 张军芳, 贾存勤, 等. 通心络超微粉联合外周血间充质干细胞移植对糖尿病足大鼠血管新生HIF-1/VEGF通路及miR-210表达的影响[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(12): 1749-54. Guo Y Y, Zhang J F, Jia C Q, et al. Treatment effect of Tongxinluo combined peripheral blood derived mesenchymal stem cells transplantation on angiogenesis of HIF-1/VEGF pathway and miR-210 in diabetic foot rat[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(12): 1749-54. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.12.024 |
| [2] | Wu J, Li J, Zhang N, Zhang C. Stem cell-based therapies in ischemic heart diseases: a focus on aspects of microcirculation and inflammation[J]. Basic Res Cardiol, 2011, 106(3): 317-24. doi:10.1007/s00395-011-0168-x |
| [3] | 孙颖, 郭勇英, 李红蓉, 等. 通心络对高脂饮食喂养大鼠糖脂代谢的影响[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(8): 1181-2. Sun Y, Guo Y Y, Li H R, et al. Effect of Tongxinluo on glucose metabolism in rat fed with high-fat diet[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(8): 1181-2. |
| [4] | 张东萍, 曹建春, 奚九一. 陈兰花冲剂对糖尿病足大鼠血清TNF-α, IL-6, CRP的影响[J]. 医学研究杂志, 2011, 40(8): 114-8. Cao D P, Cao J C, Xi J Y. Effect of Chenlanhua Chongji on serum TNF-α, IL-6, CRP of diabetic foot rat[J]. J Med Res, 2011, 40(8): 114-8. |
| [5] | Wu J, Li J, Zhang N, Zhang C. Stem cell-based therapies in ischemic heart diseases: a focus on aspects of microcirculation and inflammation[J]. Basic Res Cardiol, 2011, 106(3): 317-24. doi:10.1007/s00395-011-0168-x |