2. 江苏大学附属金坊医院检验科，江苏 金坊 213200
2. Dept of Laboratory Medicine, The Affiliated Jintan Hospital of Jiangsu University, Jiangsu Jintan 213200, China
各种细胞分泌的小囊泡根据其大小、来源途径和组成分子的不同，可分为外泌体(exosomes)、微泡(microvesicles, MVs)、凋亡小泡(apoptotic vesicles)。Exosomes来自于晚期内涵体，为30~100 nm大小的小囊泡，可从各种细胞的条件培养基或体液中用蔗糖梯度(浓度为1.13~1.19 kg·L-1)或超速离心(100 000×g)的方法分离。Exosomes富含热休克蛋白(heat shock proteins, HSP70, HSP90)，四跨膜蛋白家族分子(CD9、CD63、CD81) 和转运所需的胞内分选复合物(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)，如Alix和TSG101。MVs，也叫脱落的囊泡，核外颗粒或微粒，大小为100~1 000 nm，富含磷脂酰丝氨酸、整合素、选择素和CD40配体。凋亡小泡来自于凋亡细胞，与exosomes不同，富含膜相关的组蛋白，在高糖(1.24~1.28 kg·L-1)中悬浮，大小和形态存在高度异质性。但由于分离和纯化小囊泡的方法不同，很难严格地对胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)进行分类。EVs蛋白为表达于脂质双分子膜上，来自于母体细胞的刺激受体，包裹的分子被受体细胞摄取后，可在受体细胞中发挥功能，因而使得EVs可用于治疗。EVs临床应用主要分为两大类：① EVs作为生物药物，即特殊细胞分泌的EVs含有的某些分子具有治疗作用，主要应用于免疫抑制、免疫活化，或组织修复、血管生成等。② EVs作为药物传递系统(drug-delivery systems, DDSs)。EVs可作为天然纳米载药系统，将其运载的药物传递至靶细胞。本文主要综述目前EVs作为生物药物和药物传递系统的研究进展，并探讨其临床应用的可能性。
1 EVs的生物药物应用 1.1 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)来源EVs的治疗作用MSCs是一种具有自我更新的前体细胞，能够分化为多种细胞类型，包括骨、软骨、肌肉、骨髓、脂肪等；MSCs具有组织修复功能，可修复血管、肺、肾、骨及软骨等。而且，MSCs具有免疫抑制活性，可抑制固有和获得性免疫反应。同种异基因MSCs移植，可抑制移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)。MSCs可预防肌萎缩性晚期硬化症、多发性硬化症、帕金森病及青光眼。近年来的研究表明，MSCs来源的exosome具有与MSCs相似的功能。MSC来源的EVs治疗GVHD可减少外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中致炎性细胞因子的产生。骨髓MSCs来源的EVs可抑制大鼠的肺动脉高压和小鼠大肠杆菌(E.coli)内毒素引起的急性肺损伤[1]。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)可通过分泌exosome发挥免疫调节作用，在炎症因子IFN-γ刺激下，hUC-MSCs分泌的exosome可促进调节性T细胞的生成，其exosome可能是潜在的免疫抑制载体[2]。因而，MSCs来源EVs可代替MSCs抑制炎症反应，并可避免MSCs治疗引起潜在的致瘤副反应，因而越来越受到广泛关注。
1.2 细胞或蠕虫EVs的免疫治疗作用抗原递呈细胞(antigen-presenting cells, APCs)是一种重要的免疫细胞，包括B细胞、巨噬细胞(Mφs)、树突状细胞(DCs)，可提呈抗原至其表面的MHC分子，抗原-MHC分子复合物与T细胞受体(TCR)相互作用后引起T细胞活化。近来的研究表明，来自于APCs的EVs表面也可以表达MHCs和共刺激分子，刺激T细胞，活化获得性免疫反应。Martin-Jaular等[3]报道，感染非致命约氏疟原虫17X株的BABL/c小鼠外周血来源EVs，免疫小鼠可诱导抗约氏疟原虫抗原的IgG抗体，识别约氏疟原虫感染的红细胞，保护小鼠正常红细胞抗易致死约氏疟原虫17XL株的攻击感染。而且，OVA蛋白负载的、来自于DCs的EVs(dexosomes)，能以CD4+T细胞依赖的方式抑制黑色素瘤进展[4]。DCs负载黑色素瘤细胞B16F10裂解物产生的dexosomes含有肿瘤抗原，可诱导黑色素瘤特异的CD8+T细胞活化，募集CD8+T细胞、NK、NKT细胞至C57BL/6小鼠皮下B16F10黑色素移植瘤，抑制肿瘤进展，延长小鼠存活时间。
骨髓来源的DCs(bone marrow-derived DC, BMDCs)培养时加入IL-4和IL-10，可分化为免疫抑制性DCs。来自于免疫抑制性DCs EVs可抑制模型小鼠的迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity, DTH)和风湿病[5]。来自于表达IL-4或FasL BMDCs的EVs可抑制胶原诱导的关节炎小鼠的DTH反应[6]。
除了上述免疫细胞EVs具有治疗作用外，近年来，一项最吸引人的报道是运用蠕虫EVs调节免疫反应。因为蠕虫可调节宿主的免疫反应，蠕虫exosomes中含有小RNAs和蛋白，可抑制过敏原的Th2及嗜酸性粒细胞反应，或者诱导DCs凋亡和耐受，抑制其免疫功能[7]。因而，上述研究表明，EVs可调节免疫系统，在免疫系统介导的疾病中具有治疗潜力。
2 EVs作为药物传递载体 2.1 EVs与常规DDSs的比较目前最常用的DDSs是脂质体和多聚物纳米粒子[8-9]。脂质体通常由单层或多层脂质双分子层小泡，由卵磷脂和磷脂酰乙醇胺或其衍生物结合胆固醇组成。目前，有19种药物的脂质体DDSs获得FDA和EMA批准，而且，近乎450种药物的脂质体DDSs正在进行Ⅰ-Ⅲ干预研究。但脂质体DSSs也存在一些缺陷，包括稳定性不高、脂肪酰基部分易氧化、药物负载率不高、脂质体靶向性不高，药物易发生渗漏等。而且，静脉注射脂质体药物可诱导补体活化，发生假过敏或急性、严重的超敏反应等[9]。与脂质体系统相比，多聚物纳米粒子有较好稳定性，但其生物相容性、长期使用的安全性等问题仍值得关注。而且，多聚物纳米粒子易被单核吞噬细胞系统快速清除，其生物半衰期较短。
与脂质体不同，EVs含有脂质层，其流动性较好；脂质层上含有的膜蛋白，具有潜在的靶向性；而且EVs修饰后可携带需要的膜融合及细胞摄取装置，易被靶细胞主动或被动获取，增强药物的传递效率。而且EVs与人体自身细胞组成相似，无免疫原性，生物相容性较好；EVs是自身细胞产物，可避免被巨噬细胞吞噬、内体途径和溶酶体所降解，从而具有长循环特点，可直接将转运的药物运送至靶细胞内。因而，与常规DDSs相比，EVs的天然特点和结构组成，可作为更好的DDSs，开辟了药物传递的新途径。
2.2 EVs DDSs的细胞获取和药物负载EVs的细胞获取优于传统的脂质体或纳米颗粒载体。Batrakova等[10]报道，相较于100 nm聚乳酸-共-乙醇酸[poly (lactic-co-glycolic acid), PLGA]或脂质体相比，药物负载的exosomes更易聚集于PC12细胞，体外巨噬细胞来源的exosomes负载的过氧化氢酶鼻内免疫后更易聚集于小鼠大脑神经元和小胶质细胞，克服了常规DSSs粘膜和血脑屏障的局限。
Fuhrmann等[11]用多种卟啉类化合物等疏水性药物，比较了各种被动和主动药物负载的方法，即：电穿孔、皂素处理、挤压和透析，结果发现，MDA-MB231乳腺癌细胞、人脐静脉内皮细胞、人间充质干细胞来源EVs负载的卟啉均比脂质体负载或游离的卟啉具有更好的细胞摄取率，以及卟啉经光诱导后对细胞更强的杀伤作用。而且，EVs被动负载疏水性化合物的负载率比脂质体要高，可能脂质体中缺失EVs膜上的特殊结构，从而影响药物的负载率。
EVs负载小RNAs，通常用电穿孔的方法。Ohno等[12]报道，电穿孔负载let-7a的exosomes可靶向至RAG2-/-小鼠皮下种植的、表达表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)的乳腺癌细胞，为表达EGFR的细胞提供可靶向的miRNA治疗。除了电穿孔，遗传修饰EVs的母代细胞，被提取的EVs中可携带经遗传修饰编码的特定蛋白。Haney等[13]报道编码过氧化氢酶的质粒DNA转导巨噬细胞后，其分离的EVs成功地携带过氧化氢酶基因，并且可用于治疗小鼠帕金森病。因而，EVs作为DDSs可提高药物的负载率、在体循环时间，提高细胞获取率及传递效率，且可避免负载的药物被体液中的酶所降解。
3 EVs作为药物传递系统的载体 3.1 EVs作为抗肿瘤药物的载体目前，EVs通常被用来作为抗肿瘤药物的载体。Guo等[14]报道，来自于淋巴细胞白血病细胞(L1210) 抗原/LPS负载DCs的EVs，经环磷酰胺和poly(I:C)负载后可诱导DCs成熟，可有效抑制DBA2小鼠的肿瘤生长，延长小鼠存活时间。因而表明，结合肿瘤疫苗及抗癌药物，可促进DCs成熟，代表一种有用的抗癌治疗策略。MSCs EVs也常用于作为传递抗癌药物的载体，Pascucci等[15]报道，用紫杉醇(PTX)致敏MSCs，MSCs可经EVs释放PTX，有效抑制胰腺肿瘤进展。而且，Tian等[16]用不成熟DCs(iDCs)来源的EVs经电穿孔负载多柔比星(Dox)治疗BALB/c裸鼠肿瘤，结果发现，iDCs表达exosome膜蛋白Lamp2b融合αν整合素特异的iRGD肽(CRGDKGPDC)，体外可有效传递Dox至αν整合素阳性的乳腺癌细胞；静脉注射该exosome，可有效传递Dox至肿瘤组织，抑制肿瘤进展且毒性较低，该研究结果表明通过靶向修饰exosomes，可有效进行药物靶向传递，具有很好的临床应用潜力。但肿瘤来源的EVs可通过诱导调节性T细胞的生成，抑制肿瘤特异性的CD8+T细胞反应，促进肿瘤进展[17]。因而，应尽量避免用肿瘤细胞来源的EVs作为抗肿瘤药物的载体。
3.2 EVs作为抗炎药物的载体EVs作为抗炎药物的载体，目前报道最多的是传递姜黄素，一种在姜黄根茎中发现的天然多酚(姜黄)，具有抗炎、抗癌、抗氧化等多种生物学活性。由于姜黄素是疏水性药物，水溶性较差，因而体内吸收性不好，生物利用度不高。为了克服这些缺点，多种传递策略包括卵磷脂脂质体(小单层囊泡)、胶束、环糊精和脱乙酰壳多糖均被报道，用来传递姜黄素。2010年，Sun等[18]用小鼠的淋巴瘤细胞EL-4、小鼠巨噬细胞RAW264.7的exosomes传递姜黄素，结果表明，姜黄素优先与exosomes的脂质膜相互作用，经exosomes传递的姜黄素更稳定，血药浓度更高，表明有很好的吸收度及生物利用性。在LPS诱导的感染性休克小鼠模型中，exosomes包裹的姜黄素抑制LPS诱导的炎症比游离姜黄素更有效。该研究表明EVs可作为抗炎药物传递的载体。Zhang等[19]采用鼻腔给药EVs包裹的姜黄素，可快速传递姜黄素至大脑，明显抑制小鼠模型中脑部GL26肿瘤的生长、LPS诱导的脑部炎症，以及髓鞘少突胶质糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein, MOG)多肽诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的发生。表明EVs可携带药物穿过血脑屏障，为治疗脑部疾病提供了一种新颖的、非侵入性的方法。
3.3 EVs传递核酸类药物据报道，EVs携带的核酸具有较高的稳定性，因而在运送核酸类药物方面越来越受到关注。Alvarez-Erviti等[20]运用自体DCs来源的exosomes为载体；基因工程修饰DCs使其表达exosome的膜蛋白Lamp2b和神经元特异的RVG短肽，使其可特异地靶向于神经细胞；该exosomes经电穿孔负载GAPDH siRNA，静脉注射后可特异地传递GAPDH siRNA至大脑中神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞。结果表明，EVs可通过表面修饰后特异靶向于神经细胞，通过血脑屏障，运送核酸药物，抑制大脑中靶基因的表达。Ohno等[12]报道，HEK293细胞经基因工程修饰表达血小板来源的生长因子受体跨膜结构域，并融合EGFR的配体GE11肽。提取该细胞的exsomes负载肿瘤抑制性let-7a，静脉注射后，可抑制RAG2 KO小鼠异种移植的乳腺癌细胞的进展。MSC来源的EVs负载miR-146b可抑制大鼠脑胶质瘤生长[21]。MSCs可大量产生exosomes，是一种合理的药物传递载体。
4 EVs作为药物载体在临床实验中的应用由于EVs的独特性以及在临床前实验中可喜的实验结果，EVs作为治疗药物载体正在如火如荼地进行。大量的临床实验已完成或正在验证其治疗效应和安全性。运用肿瘤多肽/药物负载的exosomes治疗转移性黑色素瘤、进展性非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌(CRC)和恶性神经胶质廇的Ⅰ期临床实验正在进行[22-23]。
表达MAGE-3抗原的Ⅲ/Ⅳ期黑色素瘤患者，用自体DCs来源的dexosomes负载MAGE-3多肽(HLA-A1/B35)，连接MAGE-3 Ⅱ类肽(DP04) 或破伤风毒素Ⅱ类表位进行治疗。15名患者经治疗后，有5名患者经检测原发肿瘤大小及淋巴结浸润程度均获得临床改善。13名表达MAGE-A3或A4的Ⅲb、Ⅳ期NSCLC患者经自体DCs来源的dexosomes负载的MAGE-A3、A4、A10、DP04肽治疗，9名患者完成了治疗，有些病人获得了长期的疾病稳定及中等程度的免疫活化效应，但总体没有诱导明显的MAGE肽特异的T细胞反应。随后，他们调整了肽的组成，用IFN-γ刺激的dexosomes负载多肽治疗非手术的NSCLC的Ⅱ期临床实验正在进行[24]。Dai等[23]报道用腹水来源的exosomes或exosomes结合GM-CSF刺激后治疗HLA-A*201和CEA阳性的Ⅲ、Ⅳ CRC患者。37名患者完成了治疗，只有1例受GM-CSF刺激的exosomes治疗患者诱导了抗肿瘤的细胞毒T细胞反应，但单独的exosomes治疗没有效果。目前仅有一例非癌症治疗的Ⅰ期临床实验，即用脐血来源的MSC exosomes治疗20例1型糖尿病患者，减轻炎症，提高胰岛β细胞的数量，控制血糖[25]。
上述Ⅰ期临床实验表明EVs，尤其是自体EVs作为治疗载体，可避免严重的副反应。用自体dexosomes负载MAGE3肽治疗转移性黑色素廇，一名患者持续治疗了21个月[22]。被报道的副反应仅限于注射部位的炎症反应、稍微发热。没有1例Ⅰ期临床实验报道有严重的毒副反应或严重的免疫反应。但这些实验仍处于早期评价阶段，EVs作为治疗载体仍需进行长期的安全性评价。
5 结论近年来，EVs相关的研究得到了快速发展。EVs可起到其分泌细胞相似的功能，可代替活细胞移植进行治疗，并且可避免活细胞治疗所带来免疫原性、致瘤及感染潜力副反应。另一方面，EVs可作为DDSs载体。EVs可经体液传递药物分子至远端细胞，而没有明显的毒性及抗原性，比传统的DDSs具有更大的优势，成为近年来研究的热点。目前，EVs作为生物纳米载体已被成功地用于传递小分子化学药、siRNA、蛋白以及mRNA进行临床前研究。但是临床转化仍需要提高有效的EVs分离、药物负载技术，以及详细的EVs生理学功能知识。尽管EVs作为DDSs仍存在不少挑战，但目前EVs在治疗致命的，缺少有效药物治疗的重大疾病，如越过血脑屏障治疗脑部疾病方面，仍显出了无与伦比的优势。
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