2. 潍坊医学院 医学研究实验中心、山东 潍坊 261053;
3. 潍坊医学院 护理学院，山东 潍坊 261053
2. Medicine Research Center, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China;
3. College of Nursing, Weifang Medical University, Weifang Shandong 261053, China
上皮-间质转化 (epithelial-mesenchymal transition, EMT) 是上皮细胞失去极性，获得间质形态的一个过程[1]。肿瘤细胞中，EMT的激活促进了肿瘤的侵袭转移。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) 属于TGF家族，它能够调节细胞增殖、分化、细胞凋亡及细胞外基质的生成等[2]。在生理和病理状态下，TGF-β1都是EMT发生的主要诱导因子之一。本文通过TGF-β1诱导乳腺癌细胞MCF-7，检测细胞中EMT相关蛋白vimentin、E-cadherin的表达，F-actin的聚合情况以及LIMK、cofilin的磷酸化水平，进一步阐明TGF-β1促进乳腺癌细胞MCF-7 EMT的分子机制。
1 材料与方法 1.1 材料TGF-β1购自Peprotech公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体、鼠抗人E-cadherin单克隆抗体、鼠抗人vimentin单克隆抗体均购自Santa Cruz；兔抗人p-LIMK单克隆抗体、兔抗人LIMK单克隆抗体、兔抗人p-cofilin单克隆抗体、兔抗人cofilin单克隆抗体均购自Cell Signaling Technology；鬼笔环肽购自eBioscience；胎牛血清和MEM培养液购自美国Hyclone公司；人乳腺癌细胞系MCF-7购自美国ATCC细胞库。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人乳腺癌细胞系MCF-7培养在含10%的胎牛血清、青链霉素的MEM培养基中，置于含5% CO2、37℃的培养箱中传代培养。采用对数期细胞铺到6孔板中，待其长到70%左右时弃去培养液，加入无血清的MEM培养基饥饿12 h后。将人乳腺癌细胞系MCF-7分组：A组细胞不加TGF-β1，作为阴性对照；B组细胞用TGF-β1进行诱导刺激。以时间梯度24、48、72 h进行诱导刺激。
1.2.2 Transwell侵袭实验按文献[3]的步骤进行操作。在光学显微镜下随机选取5个视野，对穿到人工基膜底部的细胞进行观察计数。每个实验独立重复3次，取平均数作为最终实验结果。
1.2.3 F-actin聚合实验将A、B两组细胞的悬浊液铺在激光共聚焦培养皿中，培养72 h后，用4%的多聚甲醛固定。PBS清洗，加入1%的BSA进行封闭。封闭20 min后，加入phalloidin (1 :50) 于37℃孵育箱中孵育1 h。PBS清洗，随后加入DAPI染核，染核20 min后，加入抗淬灭剂封片。
1.2.4 Western blot细胞提取总蛋白，以等量蛋白上样到12%的SDS-PAGE中进行电泳，电泳后蛋白分离并转到PVDF膜上。用脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗孵育1 h。TBST洗膜后，加入化学发光剂ECL，X线胶片曝光。
1.3 统计学分析所有数据采用SPSS17.0进行统计学分析。所有计量资料数据用x±s表示，两组定量数据的比较采用独立样本t检验。
2 结果 2.1 TGF-β1促进MCF-7细胞发生EMTWestern blot结果显示，在用TGF-β1诱导的时间梯度24、48、72 h中，刺激时间在72 h发生EMT最为明显。乳腺癌细胞MCF-7中E-cadherin蛋白水平下调，而vimentin蛋白水平上调 (P＜0.05)。
2.2 TGF-β1促进了乳腺癌细胞MCF-7的侵袭Transwell侵袭结果显示，用TGF-β1诱导72 h的MCF-7细胞，其穿到滤膜底部的细胞数明显多于未用TGF-β1诱导的细胞数，两者比较差异有统计学意义 (P＜0.05)。
2.3 TGF-β1诱导MCF-7细胞发生EMT后F-actin聚合作用的变化情况免疫荧光检测F-actin聚合的变化结果显示，在用TGF-β1诱导72 h后，TGF-β1诱导的乳腺癌细胞MCF-7中F-actin的聚合作用比未诱导的乳腺癌细胞MCF-7明显增加 (P＜0.05)。
2.4 TGF-β1促进了MCF-7细胞中LIMK和cofilin的磷酸化检测了LIMK和cofilin的磷酸化水平。结果显示，用TGF-β1诱导72 h后，LIMK和cofilin的磷酸化明显增加 (P＜0.05)。
3 讨论肌动蛋白解聚因子丝切蛋白家系 (ADF/cofilin) 是一种肌动蛋白结合蛋白，它能够切割F-actin，加快F-actin的解聚[4]。cofilin通过调节肌动蛋白骨架的重塑，对肌动蛋白相关细胞活动具有重要作用[5-6]。LIMK是cofilin的上游信号分子，通过磷酸化cofilin氨基端第3位丝氨酸 (Ser-3) 使得cofilin失去解聚肌动蛋白的能力，提高F-actin的稳定性。F-actin的聚合与解聚合与肿瘤的侵袭转移密切相关。研究发现，F-actin的解聚使得RhoA失活，促进EMT相关转录因子Snail和Smad1/2/3由细胞核向细胞质转移，发生EMT的逆转[7]。
本研究发现，TGF-β1在诱导MCF-7发生EMT的过程中p-LIMK、p-cofilin的表达明显增强，F-actin的聚合明显增加。E-cadherin蛋白水平下调，而vimentin蛋白水平上调。结果证实TGF-β1可以通过LIMK/cofilin信号通路影响F-actin的聚合，促使EMT的发生，阐述了TGF-β1促进EMT的发生机制，为抑制乳腺癌的侵袭转移以及提高乳腺癌患者的生存率提供了理论依据。
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