脊髓缺血/再灌注损伤是胸腹主动脉瘤手术最严重的并发症，是急需攻克的难题。血-脊髓屏障破坏是脊髓损伤的重要继发病理改变，而且进一步加重脊髓损伤[1]。MicroRNA在转录后水平调控基因表达，是目前研究基因治疗和寻找药物靶点的重要工具。最近研究证实，miR-122a介导紧密连接蛋白occludin的mRNA降解增加肠道通透性[2-3]。有关miR-122a在脊髓损伤中的作用及可能的机制目前尚不清楚。本研究拟探讨miR-122a对脊髓缺血/再灌注损伤后血-脊髓屏障的影响及其相关机制。
1 材料与方法 1.1 动物选择与分组SD大鼠36只，由中国医科大学实验动物中心提供，体质量200~250 g。采用随机数字表法，随机分为3组 (n=12)：假手术组 (S组)、对照组 (C组)、miR-122a反义寡核苷酸 (miR-122a antagomir) 组 (M组)。S组开胸游离主动脉弓，但不阻断；C组和M组开胸阻断主动脉弓14 min造成脊髓缺血/再灌注损伤。M组和C组在脊髓缺血/再灌注损伤后30 min鞘内注射20 μL miR-122a antagomir (20 μmol·L-1，广州锐博公司)，每日注射1次，共3次。C组脊髓缺血/再灌注损伤后鞘内注射等量miR-122a antagomir空白对照。实验室光照时间6 :00~18 :00，温度控制在18℃~22℃，造模后分笼饲养，保证充足的水和食物。
1.2 脊髓缺血/再灌注损伤模型的建立大鼠腹腔注射戊巴比妥钠 (40 mg·kg-1) 麻醉，经气管切开处行气管内插管机械通气。直肠内置入温度传感器，持续监测体温，应用电热毯维持核心温度 (37.5±0.5) ℃。脊髓缺血/再灌注损伤模型参照文献[4]制备。左颈总动脉置管测量近端动脉血压，尾动脉置管测量远端血压。摆右侧卧位，于左前肢和肩胛下角间行横切口，逐层分离暴露肋骨，于第2、3肋之间暴露胸腔，分离并显露主动脉弓。皮下注射肝素 (200 IU·kg-1)，于左颈总动脉和左锁骨下动脉之间夹闭主动脉，阻断14 min后开放动脉夹，造成脊髓缺血/再灌注损伤。关胸，逐层缝合。术后将动物放置28℃的保温箱内，等待动物苏醒后回笼饲养。
1.3 Real-timePCR脊髓缺血/再灌注损伤后72 h，取新鲜缺血节段脊髓组织，根据TRIzol操作说明，提取细胞总RNA。提取的总RNA定量后，对于蛋白编码基因使用Oligo (dT) 作为逆转录引物，对于miRNA使用miRNA特异的逆转录引物，使用反转录试剂盒合成cDNA第一链。使用适量的cDNA作为PCR模板，MX3000P Real-time PCR扩增仪进行PCR反应，SYBR染料实时检测扩增产物的量，以GAPDH为内参分析蛋白编码基因表达情况，以U6为内参分析miRNA的表达情况。所使用引物序列如下：U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物5′-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，GAPDH下游引物5′-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′。
1.4 Western blot脊髓缺血/再灌注损伤后72 h，取新鲜缺血节段脊髓组织，迅速液氮冷冻保存。标本取齐后，剪碎，加组织裂解液，冰上匀浆，4℃离心15 min，取其上清液，BCA法蛋白定量，经电泳、转膜、醋酸纤维素膜包被后，加入兔抗大鼠occludin一抗 (1 :500，Invitrogen公司)，4℃孵育过夜，加入HRP标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，TBST冲洗，化学发光，凝胶成像系统拍摄。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对其进行半定量分析。
1.5 血-脊髓屏障通透性测定脊髓缺血/再灌注损伤后72 h，经鼠尾静脉缓慢注射2%伊文思蓝10 mL·kg-1，1 h后麻醉，经左心室灌注生理盐水500 mL·kg-1，取出脊髓缺血节段 (L4-6)，迅速放入40 g·L-1多聚甲醛中，24 h后依次置于150、200、300 g·L-1的蔗糖中沉糖，沉糖完毕后包埋，冰冻切片，置于荧光显微镜绿色激光下观察。依照荧光光斑的大小、疏密、强弱来评价脊髓组织中伊文思蓝外渗量。
1.6 大鼠神经运动功能评价采用Basso Beattie Bresnahan (BBB) 评分标准对大鼠下肢运动神经功能进行评价。
1.7 统计学处理采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，数据以x±s表示，统计学处理采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 Real-timePCR检测脊髓组织中miR-122a表达与S组 (1.00±0.07) 相比，C组miR-122a表达 (3.78±0.46) 增高 (P＜0.05)；与C组相比，M组miR-122a表达 (1.74±0.27) 降低 (P＜0.05)，Fig 1。
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| Fig 1 miR-122a expression at 72 h after spinal ischemia-reperfusion injury (x±s, n=6) S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P < 0.05 vs S group; #P < 0.05 vs C group |
与S组 (1.00±0.06) 相比，C组occludin表达 (0.28±0.04) 降低 (P＜0.05)；与C组相比，M组occludin表达 (0.55±0.06) 增加 (P＜0.05)，Fig 2。
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| Fig 2 Occludin expression at 72 h after spinal ischemia-reperfusion injury (x±s, n=6) S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P < 0.05 vs S group; #P < 0.05 vs C group |
脊髓缺血/再灌注损伤后，血-脊髓屏障破坏，通透性增加，与S组 (1.00±0.08) 相比，C组伊文思蓝外渗量 (6.12±0.73) 增加 (P＜0.05)；与C组相比，M组伊文思蓝外渗量 (3.24±0.38) 减少 (P＜0.05)，Fig 3。
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| Fig 3 Permeability of blood-spinal cord barrier at 72 h after spinal ischemia-reperfusion injury (x±s, n=6) A:Evans blue extravasation fluorescence; B:Quantitative analysis of evans blue extravasation.S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P < 0.05 vs S group; #P < 0.05 vs C group |
与S组 (21.0±0.0) 比较，C组BBB评分 (7.2±1.1) 降低 (P＜0.05)；与C组比较，M组BBB评分 (13.7±2.8) 增高 (P＜0.05)，Fig 4。
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| Fig 4 BBB score at 72 h after spinal ischemia-reperfusion injury (x±s, n=6) S:Sham; C: control; M:miR-122a antagomir.*P < 0.05 vs S group; #P < 0.05 vs C group |
脊髓缺血/再灌注损伤是胸腹主动脉瘤手术最严重的并发症之一，可引起脊髓功能障碍，甚至截瘫。血-脊髓屏障与血-脑屏障相似，是一个复杂的细胞系统，调节脊髓液体微环境在较小的范围内波动，对维持中枢神经系统的内环境稳定起着非常重要的作用[5]。脊髓缺血/再灌注损伤后，血-脊髓屏障完整性破坏，通透性增加，造成脊髓组织水肿、炎症以及神经元凋亡，进一步加重脊髓损伤[6-9]。紧密连接是血-脊髓屏障的结构和功能基础，occludin是第一个被分离出的组成紧密连接的完整膜蛋白，主要参与微血管内皮细胞间紧密连接的形成。研究发现，脊髓缺血/再灌注损伤后occludin表达减少，导致血-脊髓屏障通透性增加[10]，但其机制尚不完全明确。
MicroRNA属于调控RNA家族一员。当非编码小RNA与靶mRNA完全或不完全配对时，可引起mRNA降解，或发生在mRNA水平上诱导特异性序列基因表达部分或完全抑制的过程[11]。miR-122a作为肝脏特异性高表达的microRNA，对其研究多集中在肝癌的发生发展中[12-13]。最近研究表明，miR-122a也负向调控紧密连接蛋白occludin的表达[2, 3, 14]，参与内皮细胞通透性调节，影响病理生理功能。
本研究发现，脊髓缺血/再灌注损伤后miR-122a表达上调，同时伴随occludin表达减少，血-脊髓屏障破坏。反义寡核苷酸在miRNA功能研究中是沉默miRNA的最常用，且行之有效的方法[15]。本研究鞘内注射miR-122a antagomir抑制了miR-122a表达，而且增加occludin表达，减轻血-脊髓屏障破坏，改善大鼠神经运动功能。
综上所述，miR-122a在脊髓缺血/再灌注损伤中通过调控血-脊髓屏障紧密连接蛋白occludin，进而发挥重要的作用。将其作为靶点，将为预防和治疗脊髓损伤提供新思路。
( 致谢: 本实验在中国医科大学附属第一医院实验中心、麻醉科实验室完成，在此特对以上实验室和实验过程中给予指导和帮助的老师表示感谢！ )
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