缺血性脑卒中可导致脑损伤，是引起死亡和残疾的主要原因[1]。急性脑缺血半暗带损伤的机制很多，但这些分子机制之间的相互作用目前尚不十分清楚[2]。溶栓及时恢复血供是治疗缺血性脑卒中的一种有效的治疗方式。然而，溶栓再灌注疗法通常会带来细胞生化及代谢等问题，包括活性氧过量产生、钙超载、线粒体损伤和细胞死亡，最终导致不可逆性的再灌注损伤[3]。而过量的活性氧作为细胞凋亡的一种刺激，可触发线粒体凋亡途径，致cyto C等凋亡因子的释放[4]。一旦释放入胞质中，cyto C会激活下游caspase家族。其中，caspase-9是重要的启动器，参与cyto C依赖性的caspase级联反应，而caspase-3则参与凋亡信号的转导。
《本草纲目》记载：胡黄连味苦性寒，具有“清热燥湿”作用。《本草经疏》曰：胡黄连“大寒至苦，极清之性，能清热，一切湿热、邪热、阴分伏热所生诸病，莫不消除”。现代医学研究表明，西藏胡黄连提取物含有胡黄连苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3种环烯醚萜苷，其中胡黄连苷Ⅱ为主要有效成分，含有邻苯二酚基结构，具有较好的抗氧化作用。本课题组前期研究探讨胡黄连苷Ⅱ时间效应窗[5]，在脑缺血半暗带损伤中具有抗炎[6-7]、抗氧化[8]、抑制神经凋亡的作用[9-10]，然而，其保护神经细胞的机制还有待研究。由于cyto C/caspase-9/caspase-3信号通路在神经细胞的凋亡中起重要作用，本实验以此为切入点，进一步探讨胡黄连苷Ⅱ对脑缺血/再灌注半暗带损伤的保护作用机制。
1 材料与方法 1.1 缺血/再灌注模型制备健康成年Wistar ♂大鼠120只，体质量240~270 g，SPF级，青岛市药品检验所实验动物中心[SCXK (鲁)20100010]提供。大鼠术前禁食12 h，水合氯醛溶液 (100 g·L-1) 麻醉后固定于手术台。用牙科钻定位 (前囟左旁开5 mm、向后3 mm) 钻孔至硬脑膜，将激光多普勒血流检测仪 (PE-5001，Swedan) 探头经孔固定在硬脑膜上，记录左侧大脑中动脉供血区的血流变化，应用线栓法[11]制备缺血/再灌注 (I/R) 模型，缺血2 h时后，拔出线栓实现24 h再灌注。模型成功标准：插入线栓后，局部脑血流量峰值降到插线前的30%及以下，拔出线栓后，rCBF恢复至插线前的80%及以上为模型成功的标准。造模成功的96只大鼠随机分为假手术组 (Sham)、模型组 (Model)、治疗组Ⅱ组 (Treatment)、阳性对照药组 (Positive)、阳性对照药+治疗组 (Positive+Treatment)、阴性对照药组 (Negative)、阴性对照药+治疗组 (Negative+Treatment)、溶媒组 (DMSO)，每组12只。
1.2 干预措施假手术组线栓进入颈内动脉10 mm后即刻退出。模型组建立模型，缺血2 h拔线栓后，腹腔注射生理盐水0.5 mL。治疗组将胡黄连苷Ⅱ(天津奎青有限公司) 配制为10 g·L-1的溶液，在缺血2 h拔线栓时，腹腔注射胡黄连苷Ⅱ溶液 (20 mg·kg-1)。阳性对照药组将环孢素A (CsA，Selleck公司) 用DMSO配制成2 μmol·L-1的溶液，再灌注前15 min侧脑室注射5 μL (脑立体定向仪，江湾Ⅰ型C，上海第二军医大学修配厂)。阳性对照药+治疗组与阳性对照药组相同，CsA溶液注射结束后，给予胡黄连苷Ⅱ溶液。阴性对照药组苍术苷 (Atr，上海同田生物技术有限公司) 用生理盐水配制成2 mmol·L-1的溶液，再灌注前15 min侧脑室注射5 μL。阴性对照药+治疗组与阴性对照药组相同，Atr溶液注射结束后，给予胡黄连苷Ⅱ溶液。溶媒组，再灌注前15 min侧脑室注射DMSO溶液5 μL。
1.3 脑梗死体积测量 (TTC)每组取4只动物，脑缺血/再灌注24 h后，水合氯醛溶液 (100 g·L-1) 腹腔注射麻醉，断头取脑。生理盐水将脑冲洗干净，置于脑模具中。-20℃冷冻10 min后，自前向后连续冠状切面切片 (每片2 mm)，每个脑切5片，置于20 g·L-1的TTC磷酸盐溶液中，37℃孵育10 min。数码相机拍照，采用Adobe PhotoShop CS测量脑梗死体积。脑梗死体积 (cerebral infract volume，CIV)=经过视交叉平面的脑梗死面积/该层对侧半球面积。
1.4 免疫组化每组取4只动物，于缺血2 h再灌注24 h后，水合氯醛溶液 (100 g·L-1) 麻醉后，心脏灌注生理盐水和多聚甲醛溶液 (40 g·L-1) 各200 mL，取缺血部位脑组织。将组织置于多聚甲醛溶液 (40 g·L-1) 中固定2 h，蒸馏水浸泡4 h。常规脱水、透明、浸蜡、包埋。石蜡切片机连续冠状切片，每片厚5 μm，贴于载玻片上，常温保存。石蜡切片常规脱蜡、水化后，按二步法免疫组化试剂盒 (北京中杉金桥生物公司) 进行染色。胞质出现棕黄色颗粒者为阳性细胞，阴性对照以PBS替代抗体，不出现阳性细胞。在400倍显微镜下进行观察，每张切片随机观察5个不重叠视野，计数阳性细胞数 (PCI=阳性细胞数/细胞总数)，取其均值。
1.5 浆蛋白提取每组取4只动物，缺血2 h再灌注24 h后，水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，经心脏灌注生理盐水200 mL。每组取新鲜缺血脑组织100 mg，剩余冻存，用于总蛋白提取。根据线粒体/胞质制备试剂盒 (C3606，碧云天生物公司) 提取浆蛋白。将100 mg新鲜缺血脑组织剪碎，放入小容量玻璃匀浆器内，按1 :10(重量:体积) 加入添加蛋白酶抑制剂的分离液A，600×g，4℃离心10 min。取上清，11 000×g，4℃离心15 min。将上清再次12 000×g，4℃离心15 min，取上清为浆蛋白。取少量BCA检测蛋白浓度，剩余加入SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5×) 混匀，置于97℃水浴8 min，冷却后-20℃保存。
1.6 总蛋白提取和Western blot分析取上述脑组织各100 mg，按组织与细胞裂解液10 mg :100 μL的比例加入细胞裂解液 (碧云天生物公司)，置于冰上研磨。10 949×g，4℃离心15 min后取上清，BCA检测蛋白浓度，剩余加入SDS-PAGE Sample Loading Buffer (5×) 混匀，置于97℃水浴8 min，冷却后-20℃保存。各组均取样品20 μg，10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转法转至NC膜 (66485，Pall Corporation，USA)，5% BSA室温封闭2 h，加入cyto C (1 :5 000)、caspase-9(1 :2 000)、caspase-3(1 :2 000)、β-actin (1 :3 000) 一抗，4℃过夜。HRP标记的山羊抗兔二抗 (1 :2 000) 室温孵育1.5 h，凝胶成像分析系统 (Biospectrum 810 Imaging system，UVP，USA) 测定各条带的灰度值。计算各目的蛋白的相对灰度值 (relative value of protein，RVP)。
1.7 统计学处理所有数据均采用SPSS11.0软件进行统计学分析。实验结果以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两之间比较采用最小显著差数法 (LSD)。
2 结果 2.1 脑梗死体积方差分析显示，不同处理组之间对I/R大鼠的脑梗死体积差异有统计学意义 (F=33.87，P＜0.05)，I/R组、阴性对照药组、溶媒组梗死体积明显高于其他处理组。LSD两两比较显示 (Fig 1)：假手术组大鼠未见脑梗死；模型组大鼠可见明显梗死灶，与假手术组相比差异有统计学意义 (t=12.21，P＜0.05)；治疗组大鼠脑梗死体积明显缩小，与模型组相比差异有统计学意义 (t=4.61，P＜0.05)；阴性对照药组大鼠梗死灶明显，阴性对照药+治疗组与阴性对照药组相比，梗死体积明显缩小 (t=4.01，P＜0.05)。
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| Fig 1 Effect of picroside Ⅱ on the infarct area A: TTC staining showed the effect of picroside Ⅱ on cerebral infarct area; B: The quantification results of TTC staining. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs Atr group |
方差分析示不同组别之间差异有统计学意义 (F=22.86，P＜0.05)。LSD显示 (Fig 2)：假手术组大鼠神经细胞胞质cyto C蛋白表达微弱，着色较浅。模型组大鼠胞质cyto C蛋白表达明显增多，阳性细胞数多于假手术组 (t=9.80，P＜0.05)。治疗组大鼠胞质cyto C蛋白表达明显低于模型组 (t=4.06，P＜0.05)。阴性对照组大鼠阳性细胞较多，阴性对照+治疗组与阴性对照组相比阳性细胞数减少，差异有有统计学意义 (t=3.90，P＜0.05)。
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| Fig 2 Effect of picroside Ⅱ on cyto C expression in I/R rats (×400) A: Positive cells were measured by DAB assay and observed by microscopy; B: The PCI of picroside Ⅱ on cyto C expression in I/R rats. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+ picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs Atr group |
方差分析可见不同处理组之间存在差异 (F=15.55，P＜0.05)。LSD两两比较显示 (Fig 3)：假手术组大鼠神经细胞caspase-9蛋白表达较弱，着色不明显；模型组大脑皮层可见明显棕黄色颗粒的caspase-9阳性细胞，数目较多，蛋白表达较假手术组明显增强 (t=7.95，P＜0.05)；治疗组脑组织中caspase-9阳性细胞数量减少，表达减弱，与模型组相比差异有统计学意义 (t=4.08，P＜0.05)；阴性对照组大鼠皮质区细胞大量神经细胞固缩深染，空洞较多，可见明显棕黄色颗粒的caspase-9阳性细胞；阴性对照+治疗组阳性细胞数量下降，与阴性对照组相比差异有统计学意义 (t=4.08，P＜0.05)。
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| Fig 3 Effect of picroside Ⅱ on caspase-9 expression in I/R rats (×400) A: Positive cells were measured by DAB assay and observed by microscopy; B: The PCI of picroside Ⅱ on caspase-9 expression in I/R rats. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+ picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs Atr group |
方差分析可见不同处理组之间存在差异 (F=21.92，P＜0.05)。LSD两两比较显示 (Fig 4)：假手术组大鼠皮质区神经细胞见少量阳性caspase-3蛋白表达；模型组大鼠皮层可见明显增多的caspase-3蛋白，表达量较多，明显高于假手术组 (t=9.83，P＜0.05)；治疗组阳性细胞表达量变弱，与模型组相比差异有统计学意义 (t=4.59，P＜0.05)；阴性对照组蛋白表达量明显升高，阴性对照+治疗组与阴性对照组相比差异有统计学意义 (t=3.89，P＜0.05)。
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| Fig 4 Effect of picroside Ⅱ on caspase-3 expression in I/R rats (×400) A: Positive cells were measured by DAB assay and observed by microscopy; B: The PCI of picroside Ⅱ on caspase-3 expression in I/R rats. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+ picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs Atr group |
Cyto C蛋白表达采用胞质细胞提取法。方差分析可见不同处理组之间存在差异 (F=17.20，P＜0.05)。LSD两两比较显示 (Fig 5)：假手术组大鼠可见少量cyto C表达。模型组大鼠cyto C蛋白表达量明显上升，与假手术组相比差异有统计学意义 (t=8.53，P＜0.05)。治疗组cyto C表达量下降，与模型组相比差异有统计学意义 (t=4.39，P＜0.05)。阴性对照组cyto C含量明显增多；阴性对照+治疗组cyto C表达量明显下降，与阴性对照组相比差异有统计学意义 (t=3.93，P＜0.05)。
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| Fig 5 Cytosol cyto C expression in I/R rats by Western blot A: Western blot assay of cytosol cyto C expression; B: Bar graph showed the relative amounts of cytosol cyto C normalized to β-actin. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs Atr group |
方差分析可见不同处理组之间差异有统计学意义 (F=20.34，P＜0.05)。LSD两两比较显示 (Fig 6)：假手术组caspase-9蛋白表达量低；模型组大鼠caspase-9蛋白表达量较高，与假手术组相比差异有统计学意义 (t=8.91，P＜0.05)；治疗组caspase-9表达量下降明显，与模型组相比差异有统计学意义 (t=5.11，P＜0.05)；阴性对照+治疗组caspase-9表达量明显下降，与阴性组相比差异有统计学意义 (t=4.40，P＜0.05)。
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| Fig 6 Caspase-9 expression in I/R rats by Western blot A: Western blot assay of caspase-9 expression; B: Bar graph showed the relative amounts of caspase-9 normalized to β-actin. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs Atr group |
方差分析可见不同处理组之间存在差异 (F=16.34，P＜0.05)。LSD两两比较显示 (Fig 7)：假手术组大鼠caspase-3表达量较少。模型组蛋白表达上升，与假手术组相比差异有统计学意义 (t=8.18，P＜0.05)。治疗组表达明显降低，与模型组相比差异有统计学意义 (t=4.14，P＜0.05)。阴性对照+治疗组蛋白表达量明显降低，与阴性对照组相比差异有统计学意义 (t=4.81，P＜0.05)。
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| Fig 7 Caspase-3 expression in I/R rats by Western blot A: Western blot assay of caspase-3 expression; B: Bar graph showed the relative amounts of caspase-3 normalized to β-actin. 1: Sham group; 2: Model group; 3: Picroside Ⅱ group; 4: CsA group; 5: Picroside Ⅱ+CsA group; 6: Atr group; 7: Atr+picroside Ⅱ group; 8: DMSO group.*P < 0.05 vs sham group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs Atr group |
脑缺血/再灌注时，cyto C从线粒体释放入胞质引起caspase级联反应是启动凋亡程序的关键。cyto C一旦释放入胞质，即可与Apaf-1和pro-caspase-9结合形成凋亡体，激活caspase-3, 这对于缺血后神经细胞凋亡极其重要。Xing等[12]的研究表明，对于MCAO模型，缺血后处理会降低线粒体cyto C释放入胞质和caspase-3的活性，这与本实验结果一致。崔耀梅等[13]研究表明，在脑缺血/再灌注中，cyto C的释放及其下游因子的激活与MPTP的开放有关。于丽等[14]研究表明，抑制NADPH氧化酶，减少ROS的产生，对脑缺血/再灌注损伤起保护作用。以上研究说明，减少ROS及抑制MPTP的开放及cyto C的释放，对脑缺血/再灌注损伤具有保护作用。
由于caspases可自我活化并能相互激活，因此凋亡过程一旦激活，即呈级联放大作用。许多研究着力于caspases家族，以抑制caspases级联式反应作为开发治疗脑缺血药物的重点[15-16]。Caspase-9是线粒体凋亡途径中的一个必须始动子，而caspase-3是调节凋亡的关键蛋白。然而，仅通过抑制caspases来保护神经细胞是暂时的，因为线粒体通透性一旦不可逆增加，细胞凋亡将不依赖于caspases继续发生。cyto C的释放从侧面反映出线粒体通透性程度，胞质中cyto C的减少，会对凋亡体产生影响，从而使caspase-3激活受到影响，发挥保护神经细胞的作用。
环孢素A可特异性抑制cyto C的释放，故选为阳性对照药。苍术苷为cyto C的选择性激动剂，故选为阴性对照药。本实验证实，在大鼠脑缺血/再灌注模型中，环孢素A可明显抑制cyto C的表达，而苍术苷对cyto C的表达则未见明显作用。
本实验结果示，脑缺血/再灌注中，胡黄连苷Ⅱ能明显减小脑梗死体积，由此推测其对脑缺血半暗带有一定的保护作用。胡黄连苷Ⅱ对cyto C的抑制作用明显，与环孢素A相比未见明显统计学差异，这从侧面反映胡黄连苷Ⅱ对于凋亡体形成的抑制作用，其机制尚待进一步研究。胡黄连苷Ⅱ可下调caspase-9和caspase-3的表达水平，这可能与其抑制上游cyto C有关。环孢素A作为cyto C的特异性抑制剂，与胡黄连苷Ⅱ联合应用未见协同作用，其原因可能与胡黄连苷Ⅱ受体竞争性更强和胡黄连苷Ⅱ的药物浓度适中有关。苍术苷是cyto C的激动剂，与环孢素A和胡黄连苷Ⅱ的保护作用相反。本文CsA与Atr的结果与Sun等[17]结果相一致。
本研究尚存在不足之处，例如Atr组与模型组相比，脑梗死体积等不具有统计学意义；CsA组与胡黄连苷Ⅱ+CsA组比较，其梗死体积等无统计学意义。上述情况可能与以下因素有关：① 造模过程中，再灌注时间较长，不需要加激动剂通路已完全激活；② 受体饱和性，胡黄连苷Ⅱ与受体结合强，当联合用药时未发挥协同作用，尚需进一步研究。
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