表1(Table 1)
2. 山西医科大学 生理学教研室，山西 太原 030001;
3. 山西医科大学 山西省儿童医院临床检验中心，山西 太原 030001
2. Dept of Physiology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;
3. Shanxi Provincial Children's Hospital, Taiyuan 030001, China
心衰是许多心血管疾病的最终病程，也是临床患者的主要致死原因。近年来，很多学者认为心室重构是心衰的标志性特征。心室肥大是心室重构进程中出现的结构改变，可作为一个独立的临床死亡危险因素，包括细胞、分子、代谢的一系列适应性变化到失代偿性改变，最终导致心衰。在心室重构的进程中，往往伴有某些离子通道、交换体和离子泵的变化，即电重构，如心肌电压门控钙通道电流 (L-Ca2+ current, ICa-L) 的变化，瞬时外向钾电流 (transient outward K+ current, Ito)、ATP敏感性钾电流 (ATP-sensitive potassium current, IKATP) 和内向整流钾电流 (inward rectifier potassium current, IK1) 下调，钠钙交换电流[Na+-Ca2+ exchanger (NCX) current, INa/Ca]增强及钠钾泵的抑制等[1-2]。因此，通过调节离子通道或转运体功能，进而逆转心室重构已成为当前心血管领域中重要的研究内容之一。
以往研究抗心室重构药物时，内向整流钾通道 (IK1) 是一个被忽视的靶点。IK1是心肌最主要的背景外向电流，参与静息电位 (resting membrane potential，RMP) 的维持和心肌动作电位 (action potential，AP) 3期终末的复极。其分子基础主要是内向整流钾通道基因Kir2.x亚家族。以往由于缺乏IK1通道特异性激动剂/阻断剂，极大限制了该通道功能的研究。我们首次报道了一个IK1通道特异性激动剂——zacopride [3]，利用这一药理学工具药，本研究希望通过观测zacopride对左甲状腺素钠致心室重构模型的作用，观察其是否能抗心室重构并改善心功能，同时，用IK1通道相对特异性阻断剂氯喹证实该设想，并与临床治疗药卡托普利做比较，评估其治疗效果。
1 材料与方法 1.1 动物SPF级健康SD大鼠，♂，体质量 (200~250) g，由山西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK (晋)2015-0001。
1.2 药品与试剂Zacopride hydrochloride购自TOCRIS，批号：3A/178109。优甲乐 (左甲状腺素钠，L-thyroxine，L-thy)，规格为每片0.064 μmol，德国默克公司生产。氯喹 (批号：BCBG0245V)、卡托普利 (captoril)、牛磺酸 (taurine)、L-谷氨酸 (L-glutamicacid)、HEPES (N-2-hudroxyethylpiperazine-N′-2-ethane-sulfonic acid) 购自美国Sigma公司。胶原酶P购自瑞士Roche公司。其余均为国产分析纯产品。
优甲乐的有效成分为T4。将优甲乐片剂研磨后用生理盐水配制成1 g·L-1的混悬液，使用时按1 mg·kg-1·d-1取用。Zacopride原液：用去离子水配制为1 mmol·L-1储存液，使用时按需要稀释。氯喹 (chloroquine) 原液：用去离子水配制为1 mmol·L-1储存液，使用时按需要稀释。卡托普利 (captoril)：用自来水溶解卡托普利，每天新鲜配制，使用时按100 mg·kg-1·d-1取用。台氏液 (mmol·L-1)：NaCl 140，KCl 5.4，NaH2PO4 0.33，HEPES 5.0，Glucose 10，MgCl2 1.0，CaCl2 1.8，用NaOH调节pH至7.38。酶液 (mmol·L-1)：NaCl 125，KCl 5.4，CaCl2 75，MgCl2 1.0，NaH2PO4 0.33，HEPES 10，Glucose 10，Taurine 20，Collagenase P 0.1 g·L-1。KB液 (mmol·L-1)：KOH 85，L-谷氨酸50，KCl 30，Taurine 20，KH2PO4 30，MgCl2 1.0，HEPES 10，葡萄糖10，EGTA 0.5，用KOH调节pH至7.4。
1.3 仪器GE Vivid 7 Pro彩色超声诊断仪，10S探头，探头频率8.0 MHz，配备二维应变成像软件，Echo PAC工作站；Olympus FV1000激光共聚焦显微镜；Axopatch 200B膜片钳放大器 (Molecular Device，USA)。
1.4 方法 1.4.1 实验分组健康SD大鼠随机分为正常对照组、左甲状腺素模型组、zacopride 5、15、50 μg·kg-1干预组、zacopride (15 μg·kg-1) +氯喹 (7.5 μg·kg-1) 组和卡托普利阳性对照组。
1.4.2 动物模型建立方法根据吴晓冬等[4]修改。SD大鼠称重。除正常对照组外，其余各组动物均以混悬的优甲乐 (1 mg ·kg-1·d-1) 灌胃，正常对照组以等量的蒸馏水灌胃。Zacopride不同剂量组分别腹腔注射5、15、50 μg·kg-1 zacopride，zacopride+氯喹组同时腹腔注射15 μg·kg-1 zacopride和7.5 μg·kg-1氯喹，卡托普利阳性对照组按100 mg·kg-1·d-1饮水给予卡托普利。连续10 d。所有大鼠均饲以常规固体饲料和自来水，于停药24 h禁食过夜，然后观察相应指标。
1.4.3 超声心动图 (ultrasound cardiograph, UCG)检查用GE Vivid 7 Pro超声仪配备的10S探头并配备啮齿动物模式对大鼠心脏进行扫查，探查角度和深度尽量小，以提高帧频率，一般为15 °~30 °，深度为2 cm~3 cm，帧频> 250·s-1，最高帧频可达400·s-1。在左心长轴切面上测量并记录大鼠心脏的左室内径 (LVID)、室间隔厚度 (IVS)，通过M型超声获得左室射血分数 (EF) 和左室短轴缩短率 (FS)，所有数据均测量3次，取其平均值。为了减小大鼠个体大小差异造成的误差，模型大鼠采用体表面积指数进行比较，其中LV指数=LVID·体表面积-1，IVS指数=IVS·体表面积-1。大鼠体表面积计算公式:体表面积/m2=0.09 ×[体质量 (kg)]2/3。
1.4.4 心肌肥厚指数的测定停药24 h后称重 (BW)。打开胸腔，快速取出心脏，置于4 ℃预冷的生理盐水，由主动脉逆行冲洗心脏血液后，用双层滤纸吸干水分，电子天平准确称量全心湿质量 (HW)，去除心房及瓣膜组织，沿室间隔剪开左心室 (包括室间隔) 和右心室，去除大血管及心包组织，称量左心室 (包括室间隔) 质量 (LVW)，最后计算全心质量·体质量-1(HW·BW-1，mg·g-1) 比，左心室质量·体质量-1(LVW·BW-1，mg·g-1) 比，分别记为全心肥厚指数、左心室肥厚指数。
1.4.5 分离单个左心室肌细胞，记录IK1电流，ICa-L电流造模成功10 d后，各实验组动物分别取3只，在术前15 min腹腔注射肝素 (1 000 U· kg-1)，戊巴比妥钠 (65 mg·kg-1, ip) 麻醉后颈动脉放血，迅速开胸取出心脏，置于4 ℃用100%氧气饱和的无钙台氏液中修剪，然后将心脏悬挂在Langendorff灌流装置上，经主动脉逆行灌流。先用无钙台氏液灌流8~10 min，再用酶液循环灌流15~20 min。灌流过程中保持37 ℃恒温，灌流压6.86 kPa，并持续通以100%氧气。待心室肌组织变大、变软后，选取左心室，置于KB液中剪碎，轻轻吹打得到分散的左心室肌细胞，经150 μm孔径的滤网过滤后，保存于KB液中，室温放置2 h后，用含钙台式液梯度复钙，记录IK1和ICa-L电流。
1.4.6 测定心室肌细胞内游离钙离子浓度心肌细胞用PBS液冲洗2遍，用100 μL含5 μmol·L-1钙离子探针Fluo-4-AM滴于盖玻片上，37 ℃避光40 min，PBS液冲洗玻片3遍，洗去多余染料，保留少许PBS液平衡细胞10 min，于20 min内进行细胞内[Ca2+]i检测。加载好荧光染料的细胞置于共聚焦激光扫描镜的载物台上，进行形态观测，随机选取心肌细胞，计算心肌细胞表面积，测定胞内游离钙的荧光值。
1.5 统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。
2 结果 2.1 扎考比利对左甲状腺素模型大鼠心肌肥厚的影响 2.1.1 超声心动图结果与正常对照组相比，左甲状腺素模型组大鼠左室收缩期内径 (LVIDs)、舒张期内径 (LVIDd)、室间隔厚度 (IVS) 均明显增加 (P＜0.01)，射血分数 (EF) 和左室短轴缩短率 (FS) 明显降低 (P＜0.01)，提示心室肥厚和左心功能降低。大鼠经zacopride (15 μg·kg-1) 预防性给药后，左室收缩期内径、舒张期内径、室间隔厚度均较模型组明显降低 (P＜0.01)，EF、FS明显升高 (P＜0.01)，心功能恢复至正常或接近正常水平。应用低剂量氯喹 (7.5 μg ·kg-1，IK1通道相对特异性阻断剂) 阻断zacopride对IK1通道的激动效应，则可明显抑制zacopride的抗心室重构作用，提示zacopride可能通过激动心肌IK1通道而发挥抗心室重构效应。见Tab 1、Fig 1。
| n | LVIDd/mm·m-2 | LVIDs/mm·m-2 | IVS/mm·m-2 | EF/% | FS/% | |
| Control | 6 | 118.92±19.62 | 75.37±11.81 | 51.63±4.40 | 73.0±0.82 | 36.5±0.58 |
| L-thy | 8 | 181.5±19.60** | 140.68±12.97** | 68.23±4.13** | 60.8±4.66** | 28.3±3.3** |
| L-thy+Zac | 8 | 126.33±25.00△△## | 86.55±13.92△△## | 53.14±5.02△△## | 78.5±6.45△△## | 41.5±6.86△△## |
| L-thy+Zac+Chlo | 6 | 157.08±27.29** | 113.56±12.28* | 64.58±3.47** | 62.3±7.15** | 25.5±6.36** |
| L-thy: L-thyroxine; Zac: zacopride; Chlo: chloroquine. The dose of zacopride is 15 μg·kg-1. LVIDd: left ventricular dimension in diastole; LVIDs: left ventricular dimension in systole; IVS: interventricular septum thickness; EF: ejection fraction; FS: fractional shortening.*P＜0.05, **P＜0.01 vs control; △△P＜0.01 vs L-thy; ##P＜0.01 vs L-thy+Zac+Chlo | ||||||
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| Fig 1 Echocardiography of L-thyroxine-induced cardiac hypertrophy in rats A: Control; B: L-thyroxine; C: L-thyroxine+zacopride; D:L-thyroxine+zacopride+chloroquine. |
大鼠灌胃给予左甲状腺素钠连续10 d后，全心肥厚指数 (P＜0.01)、左心室肥厚指数 (P＜0.01) 较正常对照组明显增加，说明心肌肥厚模型复制成功。5~50 μg ·kg-1 zacopride可剂量依赖性拮抗心肌肥厚，其全心肥厚指数、左心室肥厚指数均较模型组降低。15 μg·kg-1为zacopride最适效应剂量 (P＜0.01)，其效应与卡托普利组相比差异无显著性 (P>0.05)；而同时应用低剂量氯喹 (7.5 μg·kg-1，IK1通道相对特异性阻断剂) 则可明显抑制zacopride的抗心室重构作用，提示zacopride可能通过激动心肌IK1通道而发挥抗心室重构效应。见Tab 2。
| n | BW/g | HW·BW-1
/mg·g-1 | LVW·BW-1
/mg·g-1 | |
| Control | 6 | 233.6±12.4 | 2.53±0.04 | 1.51±0.07 |
| L-thy | 8 | 243.8±10.7 | 4.56±0.65** | 3.17±0.24** |
| L-thy+Zac 5 μg·kg-1 | 6 | 245.5±14.3 | 3.94±0.22 △△ | 2.79±0.16△△ |
| L-thy+Zac 15 μg·kg-1 | 8 | 248.3±9.0 | 3.96±0.27 △△ | 2.74±0.23△△ |
| L-thy+Zac 50 μg·kg-1 | 6 | 243.0±5.1 | 4.29±0.23△ | 2.90±0.20△ |
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L-thy+Zac 15 μg·kg-1
+Chlo | 6 | 231.5±19.6 | 4.60±0.35 ## | 3.10±0.31## |
| Captopril | 6 | 229.3±12.2 | 4.05±0.15△ | 2.80±0.16△△ |
| **P＜0.01 vs control; △P＜0.05, △△P＜0.01 vs L-thy; ##P＜0.01 vs L-thy+Zac 15 μg·kg-1. | ||||
左甲状腺素致心室重构模型中，IK1通道内、外向电流均被抑制，其中外向电流 (-60 mV) 减少25.7%[由 (3.31 ± 0.36) pA·pF-1减少至 (2.46 ± 0.19) pA·pF-1, P＜0.01]；zacopride可使外向电流恢复至 (3.19 ± 0.29) pA·pF-1(P＜0.01)，提示zacopride可以逆转模型组IK1电流的减少；zacopride的效应可以被低剂量氯喹消除，外向电流 (-60 mV) 降低17.9%，由 (3.19 ± 0.29) pA·pF-1减少至 (2.62 ± 0.13) pA·pF-1(P＜0.01)，见Fig 2。
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| Fig 2 Effect of zacopride on IK1 in hypertrophic rat ventricular myocytes The dose of zacopride is 15 μg·kg-1.**P < 0.01 vs control; △△P < 0.01 vs L-thy; ##P < 0.01 vs L-thy+Zac+Chlo. |
ICa-L通道的变化则与IK1通道完全相反。左甲状腺素致心室重构模型中ICa-L通道在0 mV处电流增加59.5%，由 (-8.03 ± 0.56) pA·pF-1增至 (-12.81 ± 0.53) pA·pF-1(P＜0.01)；zacopride可使ICa-L降低至 (-9.29 ± 0.52) pA·pF-1(P＜0.01)，提示zacopride可以逆转模型组ICa-L电流的增加；zacopride的效应可以被低剂量氯喹消除，0 mV处ICa-L电流增至 (-11.63 ± 0.28) pA·pF-1(P＜0.01)。见Fig 3。
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| Fig 3 Effect of zacopride on ICa-L in hypertrophic rat ventricular myocytes The dose of zacopride is 15 μg·kg-1.**P < 0.01 vs control; △△P < 0.01 vs L-thy; ##P < 0.01 vs L-thy+Zac+Chlo. |
在镜下可见左甲状腺素模型大鼠左心室肌细胞宽度明显增加，细胞表面积明显增大 (P＜0.01)，胞内游离钙离子浓度增加明显 (P＜0.01)，15 μg·kg-1 zacopride干预后，细胞形态和胞内钙浓度恢复至正常或接近正常水平 (P＜0.01)，低剂量氯喹可以消除zacopride的效应 (P＜0.01)。见Tab 3、Fig 4。
| Width/μm | Area/μm2 | [Ca2+]i(CHS1) | |
| Contro | 21±4.3 | 2 369±81.5 | 992±115.7 |
| L-thy | 33±8.1** | 4 257±101.3** | 2 660±170.7** |
| L-thy+Zac | 24±9.2△△## | 3 179±90.2△△## | 909±83.2△△## |
| L-thy+Zac+Chlo | 29±7.3 | 3 891±113.8 | 1 477±96.0 |
| The dose of zacopride is 15 μg·kg-1.**P＜0.01 vs control; △△P＜0.01 vs L-thy; ##P＜0.01 vs L-thy+Zac+Chlo. | |||
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| Fig 4 Zacopride inhibited L-thyroxine-induced intracellular calcium-overload in rat ventricular myocytes A: Control; B: L-thy; C: L-thy+Zac; D: L-thy+Zac+Chlo.The dose of zacopride is 15 μg·kg-1. |
心室重构包括组织重构和电重构两部分，组织重构即心肌细胞形态，排列和间质的变化，以心肌细胞肥大及间质纤维化为特点；电重构即心肌细胞膜离子通道、交换体和离子泵的变化。Kääb等[5]于1998年就报道了心衰病人动作电位时程 (action potential duration，APD) 延长，瞬时外向钾电流Ito电流减少，内向整流钾通道IK1密度下降的现象；Zobel等[6]则认为Ito的减少，钙内流的增加，是心肌肥大电重构的主要机制。电重构不仅是心肌肥大的结果，还可先于组织重构发生，进而影响组织重构过程[7]，这提示研究者需重新探究电重构与组织重构的关系，并尝试将离子通道作为有效干预心室重构的新靶点。
甲状腺素是甲状腺分泌的激素，主要有四碘甲状腺原氨酸 (thyroxine, T4) 和三碘甲状腺原氨酸 (triiodothyronine, T3) 两型。甲状腺素通过基因或非基因作用对心血管系统产生多种效应、包括心肌收缩效应、电生理功能和心肌结构改变等[8]。过量的甲状腺激素作用于心脏上的甲状腺素核受体-α(thyroid hormone nuclear receptor α, TR-α)，通过一系列的下游信号级联反应，产生心肌肥大[8]。与此同时，甲状腺素还可通过非基因组效应影响细胞膜上离子，如Ca2+、Na+、K+的转运[9-10]。心室肥大的早期可以通过细胞肥大增强收缩功能，是一种适应性变化，又称生理性肥大，之后心室肥大会渐变为不可逆性的破坏性变化，收缩和舒张功能受损，产生病理性肥大，最终产生心衰。在这一过程中，钙稳态失衡被认为是心肌肥大发生的中心环节[11-12]。细胞膜上L型钙通道、NCX交换体，肌浆网的Ca2+-ATP酶、Ryanodine受体及钙调蛋白激酶Ⅱ(calmodulin kinase Ⅱ, CaMKⅡ)、钙调磷酸酶 (calcineurin) 等钙调蛋白的功能异常均是导致胞内钙稳态失衡的可能机制。由于L型钙通道介导的Ca2+内流是心肌兴奋收缩偶联的始动环节，因而在探讨钙稳态失衡致心肌肥大的机制时，钙通道异常往往是首先考虑的因素。本研究结果显示，左甲状腺素诱发的心肌肥大，心肌细胞膜上内向整流钾通道电流 (IK1) 被抑制，而L型钙通道电流 (ICa-L) 明显增大，胞内[Ca2+]i增多，发生了钙超载。经zacopride干预后，IK1增大，ICa-L减小，接近正常水平，并明显降低胞内[Ca2+]i, 说明zacopride可通过减轻细胞内钙超载而发挥抗心室重构效应。本课题组曾首次报道zacopride为心肌IK1特异性激动剂，可增大RMP，适度缩短APD，但其对心肌ICa-L无明显影响[3]。如何解释zacopride抑制左甲状腺素诱发的ICa-L电流，进而减轻钙超载呢？我们认为在心室重构进程中，zacopride不直接抑制心肌ICa-L，很可能通过激动IK1而增大RMP，缩短APD，两者均可减少电压门控Ca2+内流，减轻细胞内钙超载，从而发挥抗心室重构效应。
有研究表明，肾素-血管紧张素系统 (rennin-angiotensin-system，RAS) 参与了甲状腺素增多所产生的心肌肥大的过程[13]，但具体的信号转导机制还不明确。Zacopride选择性激动IK1之后的下游信号机制有待进一步研究。可以尝试联合使用血管紧张素转换酶抑制剂。
综上所述，本研究建立左甲状腺素致心室重构模型，首次利用zacopride和相对特异性IK1通道阻断剂氯喹，证明通过选择性激动心肌IK1通道可能通过减轻细胞内钙超载而发挥抗心室重构效应，但其对钙诱导的心室重构信号通路的调节作用仍需进一步研究明确。
( 致谢: 本研究在山西医科大学病理生理实验室、生理实验室完成，感谢李夏青老师、赵录英老师的支持和指导。 )
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