脑部的靶向给药系统 (targeting drug delivery system, TDDS) 是一种特异性地将药物浓集于脑部的药物载体系统。典型的TDDS需具备几个特征：脑部转运的血脑屏障 (blood-brain barrier, BBB) 通透性、脑靶向性、生物安全性等特点。目前研究的TDDS主要分为大分子载体 (蛋白类载体[1-2]和聚合物载体[3])、粒性载体 (纳米粒子[4]、脂质体等[5-6]) 和前药[7]等3类。这些载体各有利弊，为进一步提高载体通透BBB的效率和神经系统的选择性，近年来开发了新型的药物递送载体。
自然界存在对神经细胞具有高度选择性的蛋白质。我们及同行实验室目前已证明，狂犬病毒衣壳糖蛋白 (rabies virus glycoprotein, RVG) 中的多肽序列，可作为一种安全高效的脑靶向载体。在动物体内，RVG多肽片段显示出明显的嗜神经性、易穿过BBB和非侵入性的给药方式，从而得到广泛的认可。RVG肽可与多种生物分子连接，携带物质快速进入脑内，在生物分子的入脑转运中显示出明显的优势。
1 狂犬病毒衣壳糖蛋白 (RVG)RVG是唯一暴露在狂犬病毒膜外的一种结构蛋白，成熟糖蛋白由505个氨基酸组成，长约8~10 nm，相对分子质量为67 ku[8]，分为3个区域：膜外区 (C1-C439)、跨膜区 (C440-C461) 和膜内区 (C462-C505) (Fig 1) [9]。RVG也是一种重要的功能蛋白，在狂犬病毒的致病和免疫中起着关键作用，是狂犬病毒主要的保护性抗原，能够刺激机体产生中和抗体，引发机体抵抗病毒感染[8]。RVG作为病毒与宿主细胞结合的配体，介导病毒膜与细胞内囊膜融合, 从而使病毒侵入细胞。同时，它也是病毒主要的神经性致病因子，在狂犬病毒的神经嗜性、神经侵袭性及神经功能损伤中发挥重要作用[10]。
2 RVG中的脑靶向多肽序列
依照病毒能够进入神经系统的这一策略，将其用于转运治疗分子进入大脑。研究表明[11]，RVG不仅可以使狂犬病毒侵入神经细胞，还能够携带其他病毒经突触逆行转移进入中枢神经系统 (central nervous system, CNS)。RVG与其内源性受体结合后，通过受体介导的转胞吞 (receptor-mediated transcytosis, RMT) 机制进入神经细胞[12]。RVG中有3个多肽片段是RVG毒性和受体特异性结合的关键序列，分别位于RVG的30~56(VEDEGCINLSGFSYMELK)、189~214(CDIFTNSRGKRASNGNKTCGFVDERGL) 和330~357(KSVRTWNEIIPSKGCLKVGGRCHPHVNGV) 序列中[13]。将这些区域进行改造后，可得到中枢神经细胞受体特异性、无免疫反应的RVG衍生肽段 (RVG-derived peptide, RDP)。这些来源于RVG的多肽序列似乎具有RVG的某些特征，可与神经细胞特异性结合。基于RVG肽及衍生肽的嗜神经性，被用于生物大分子神经选择性摄取及脑靶向载体已经展开了深入的研究 (Fig 2)。
|
| Fig 2 The schematic drawing of RVG peptide as a brain targeting vector |
RVG肽与蛋白质通过基因重组技术共价结合形成的融合蛋白，是目前使用较为广泛的结合方式。研究表明，RVG肽与增强绿色荧光蛋白 (EGFP) 通过基因重组形成RVG-EGFP融合蛋白，可以能量依赖的方式选择性地进入神经细胞[14]。与其他细胞穿透肽 (TAT、Tet1) 相比，神经细胞对RVG-EGFP的摄取效率是TAT-EGFP的9倍，是另一种细胞穿透肽Trt10EGFP的27倍。机制研究表明，RVG-EGFP以γ-氨基丁酸 (GABA) 受体依赖和网格蛋白介导的内吞途径进入神经细胞。
将RVG肽与治疗性蛋白GDNF或BDNF连接后，可携带后者穿过血脑屏障，并发挥疾病治疗的作用[15]。此外，RVG肽与p53融合蛋白可以特异性抑制神经肿瘤细胞的生长[16]。该融合蛋白可以被SH-SY5Y细胞、U251细胞等神经肿瘤细胞明显摄取并发挥抑制作用，而在非神经瘤细胞内没有明显摄取，这为蛋白类药物对神经系统肿瘤的治疗提供了可能。
4 靶向脑内递送siRNA将RVG中29个氨基酸的短肽 (189~214片段CDIFTNSRGKRASNGNKTCGFVDERGL) 与九聚D-精氨酸肽结合组成嵌合肽RVG-9R，与一定比例的siRNA在室温下孵育后，形成RVG-9R/siRNA复合物[17-18]。细胞实验中，复合物以能量依赖的方式进入神经细胞，在细胞中siRNA发挥作用敲除gfp报告基因；动物实验中，复合物经静脉注射小鼠后，RVG-9R携带抗病毒siRNA靶向性进入中枢神经系统，在脑内进行基因治疗，且重复给药不会产生毒性和耐受性。
5 RVG肽与多聚物的组合物作为靶向脑内转运载体单独的RVG肽虽然可携带大分子物质进入神经细胞，但为提高核酸的细胞内转运效率和增加其制剂的可控性，近年来将RVG肽与聚乙酰亚胺 (PEI)、PAMAM和壳聚糖等多聚物结合形成组合物，其中在生理条件下带正电荷的多聚物用来结合核酸，而RVG肽赋予多聚物靶向性并增加细胞通透性，协同发挥作用，将药物特异性转运至神经细胞中。
5.1 RVG肽与PEI形成组合物作为核酸转运载体聚合物常作为siRNA和DNA的转运载体，尤其是可生物降解、无细胞毒性的含二硫键的聚合物[19]。阳离子聚合物，例如PEI是一种优良的基因传递载体：转导效率较高、免疫反应较低、可诱导核酸从内吞体逃逸等[20]。在分支型的PEI分子主干上引入二硫键 (SSPEI)，可以增加生物相容性和血液循环时间，并且改善内源性酶对SSPEI聚合物的降解能力[21]。SSPEI通过二硫键结合形成的多聚物具有良好的生物可降解性，并能够有效转载和释放所携带的核酸。将该多聚物与含有双功能官能团的聚乙二醇 (NHS-PEG-MAL) 一侧的NHS基团连接，RVG肽与另一侧的MAL基团结合形成具有较好的血清稳定性和有效的配位能力的BPEI-SS-PEG-RVG组合物。与一定浓度的质粒DNA孵育后，组合物携带DNA能够通过血脑屏障，并选择性在脑内进行基因表达[21]。
为进一步提高入脑效率，联用甘露醇暂时开放血脑屏障[22]，以促进RVG-SSPEI低聚物介导的miRNA向脑细胞的转运[23]。将Cy5.5荧光标记的miR-124a和RVG-SSPEI按一定比例孵育形成Cy5.5-miR-124a/RVG-SSPEI复合物。经小鼠尾静脉注射后，RVG-SSPEI聚合物能够特异性将miR-124a转运至神经细胞，后者仅能在脑部积累，提示该传递系统具有脑靶向性。此外，调节miR-124a/RVG-SSPEI的大小和甘露醇的用量，miR-124a可在脑内达到最高的有效浓度。
5.2 RVG肽与聚酰胺树状分子形成组合物靶向脑内转运DNA聚酰胺树状分子PAMAM也是一类DNA转染试剂。球形的聚合物结构可以有效包封DNA。将PAMAM与NHS-PEG-MAL共价连接以提高载体的水溶性和生物相容性[24]，然后将RVG肽键合在其表面，与DNA结合后形成PAMAM-PEG-RVG29/DNA纳米粒 (NPs)[25]。在体外BBB模型中，PAMAM-PEG-RVG29/DNA NPs比PAMAM/DNA NPs有更高的BBB穿透效率。体内成像表明，与PAMAM/DNA NPs相比，PAMAM-PEG-RVG29/DNA NPs可浓集于大脑，并且DNA在脑部的表达水平也明显提高，说明PAMAM-PEG-RVG29能够有效向脑内靶向传递DNA，其机制可能是脑毛细血管内皮细胞网格蛋白和质膜微囊以能量依赖的受体介导的内吞方式。进一步研究表明，靶向受体除与NAchR有关外[3]，还可能与B亚型GABA受体有关[19]。
5.3 RVG与壳聚糖形成组合物靶向脑内转运siRNA壳聚糖是一种多糖类的DNA和siRNA转染试剂[26]，其衍生物三甲基壳聚糖 (N-trimethyl chitosan chloride, TMC) 具有更高的水溶性和络合siRNA的能力[27]。TMC与siRNA结合后能够以吸收介导的转胞吞作用 (absorptive-mediated transcytosis, AMT) 的方式转运至细胞[28]，与PEG的连接可提高生物安全性和延长作用时间，而与RVG的偶联可使其具有靶向性。Gao等[29]尝试两种方法得到与siRNA结合的TMC-PEG-RVG复合物：一种方法是TMC-PEG与RVG肽共价结合，然后加载siRNA形成纳米颗粒 (TRs)；另一种方法是TMC-PEG先加载siRNA形成纳米颗粒，再在表面共价结合RVG肽 (TsR)。理化性质研究表明，TRs结构较大 (>200 nm)，易受巨噬细胞的吞噬，而TsR大小为 (135±7) nm，ζ电位为 (10.9±1.1) mV，并且与siRNA有良好的结合能力。体内外的实验结果证实，在siRNA/TMC-PEG-RVG复合物中，RVG肽具有脑靶向作用，PEG能增加血清稳定性以及循环时间，并且TMC对siRNA产生有效的密封，最终将siRNA特异性传送到脑部，并抑制特定基因的表达。
6 RVG肽修饰纳米粒子作为靶向脑内转运载体 6.1 蛋白质载体泊洛沙姆纳米载体能够传送治疗蛋白，并在传送及释放的过程保持蛋白分子生物活性，是一种良好的蛋白转运工具[30]。用单相光聚合作用合成纳米载体，表面加载壳聚糖以增加生物安全性，然后再将RVG29-Cys通过MAL-PEG-NC的MAL基团与RVG29-Cys的硫醇基之间的特定反应结合到纳米载体上[31]。以β-半乳糖苷酶作为模型蛋白，通过酶活性实验分析各种纳米载体传送到重要器官和脑的β-半乳糖苷酶含量。结果表明，RVG29-Cys和壳聚糖结合的纳米载体能够有效地传送β-半乳糖苷酶穿过BBB，并在脑部保持生物活性。RVG肽和壳聚糖的协同效应明显增强了β-半乳糖苷酶在脑部的相对疗效并提高了累积时间。这种转运载体是向脑内转运蛋白质的另一种方法。
6.2 基因载体修饰RVG肽的聚乙丙交酯 (PLG) 纳米颗粒可包载治疗基因，实现神经母细胞瘤靶向递送[32]。RVG肽修饰纳米粒子能够在体外和体内特异性靶向神经母细胞瘤。载有荧光探针的RVG-修饰的纳米颗粒可用于检测携带神经母细胞瘤的小鼠模型中的肿瘤位点，并且包封治疗性基因 (siMyc、siBcl-2和siVEGF) 纳米粒明显抑制模型小鼠肿瘤生长。此外，RDP修饰的金纳米簇 (AuNCs) 可用于长期、无毒的体外神经细胞成像和小鼠脑部的靶向成像[33]。细胞附着和神经细胞摄取机制的研究表明，该RDP-AuNCs的细胞摄取方式为网格蛋白受体介导，通过网格蛋白小体的内吞作用。对AuNCs的表面改性可提高细胞的选择性，并且其在生物成像中的应用将对疾病的治疗和诊断具有重要意义。
7 RVG肽修饰的脂质体作为靶向脑内转运载体 7.1 siRNA载体脂质体是由单个或多个脂质双分子层形成的球状囊泡，具有高度的生物相容性、高的传递效率和易于进行表面修饰等特点[5, 34]。Tao等[35]用DSPE、胆固醇和DSPE-PEG-Mal按一定比例形成脂质体，将RVG肽结合到脂质体表面得到空白脂质体，再将siRNA嵌入脂质体的核心，形成粒径在100~200 nm的颗粒。脂质体中，DSPE磷脂作为脂质体的双分子层，胆固醇使脂质膜具有适合的通透性和流动性，DSPE-PEG-Mal散布在磷脂双分子层表面形成一个PEG壳。这个衣壳能够产生静电作用、维持空间稳定性并连接RVG肽。活体成像和冰冻切片结果显示，RVG-脂质体能够穿过血脑屏障并浓集于脑部。这种靶向性的中空脂质体可能是向脑内传递水溶性药物的有前景的方法。
7.2 小分子化合物转运载体RVG肽修饰的脂质体除可以转运生物大分子入脑外，还可加载其他药物进行脑部疾病的治疗。RVG肽修饰的脂质体分别加载姜黄素、钌配合物等抗肿瘤药物后，可对神经瘤细胞产生明显的抑制作用[36]。RVG修饰的载体对神经细胞膜穿透效率明显，在小鼠模型中，可有效穿过血脑屏障，实现药物的脑部传送。
8 展望RVG肽作为一种脑靶向载体可以直接用于生物分子的传递。为了改善载药效率，将RVG肽与聚合物分子形成组合物及纳米粒子载体。这些聚合物分子有PEI、聚酰胺树状分子等，其具有生物相容性、可降解、无细胞毒性、易于修饰等特点。这类靶向系统可广泛用于小分子化合物、siRNA、miRNA和蛋白质的传递，还可用于加载纳米粒和脂质体制成脑靶向制剂。然而，RVG肽作为脑靶向载体还存在嗜神经机制、血脑屏障通透机制、入胞过程、体内代谢等尚不完全明确的问题，同时，如果解决该靶向肽受到免疫系统威胁的问题，可以达到更为理想的靶向效果。因此，后续研究在拓宽RVG脑靶向载体种类、治疗分子种类的同时，还需要进行更深入的机制研究。此外，神经系统肿瘤具有神经系统的某些特征，所以RVG肽在靶向神经系统肿瘤方面值得研究。总之，RVG肽的脑靶向给药系统有良好的应用前景。
| [1] | Boado R J, Zhang Y, Wang Y, et al. Engineering and expression of a chimeric transferrin receptor monoclonal antibody for blood-brain delivery in the mouse[J]. Biotechnol Bioeng, 2009, 102(4): 1251-8. doi:10.1002/bit.v102:4 |
| [2] | Fu A, Zhou Q H, Hui E K, et al. Intravenous treatment of experimental Parkinson′s disease in the mouse with an IgG-GDNF fusion that penetrates the blood-brain barrier[J]. Brain Res, 2010, 1352: 208-13. doi:10.1016/j.brainres.2010.06.059 |
| [3] | Yan H, Wang L, Wang J, et al. Two-order targeted brain tumor imaging by using an optical/paramagnetic nanoprobe across the blood brain barrier[J]. ACS Nano, 2012, 6: 410-20. doi:10.1021/nn203749v |
| [4] | Zhang S, Kucharski C, Doschak M R, et al. Polyethylenimine-PEG coated albumin nanoparticles for BMP-2 delivery[J]. Biomaterials, 2010, 31(5): 952-63. doi:10.1016/j.biomaterials.2009.10.011 |
| [5] | Schafer J, Hobel S, Bakowsky U, et al. Liposome-polyethylenimine complexes for enhanced DNA and siRNA delivery[J]. Biomaterials, 2010, 31(26): 6892-900. doi:10.1016/j.biomaterials.2010.05.043 |
| [6] | Partdridge W M. Tyrosine hydroxylase replacement in experimental Parkinson's disease with transvascular gene therapy[J]. NeuroRx, 2005, 2(1): 129-38. doi:10.1602/neurorx.2.1.129 |
| [7] | 朱世璟, 袁媛, 尹华阳, 等. 银杏内酯B前体药物的脑靶向性研究[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(4): 542-9. Zhu S J, Yuan Y, Yin H Y, et al. Brain targeting research of ginkgolide B prodrug[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(4): 542-9. |
| [8] | Mazarakis N D, Azzouz M, Rohll J B, et al. Rabies virus glycoprotein pseudotyping of lentiviral vectors enables retrograde axonal transport and access to the nervous system after peripheral delivery[J]. Hum Mol Genet, 2001, 10(19): 2109-21. doi:10.1093/hmg/10.19.2109 |
| [9] | Ross B A, Favi C M, Vásquez V A. Rabies virus glycoprotein: structure, immunogenicity and pathogenic role[J]. Rev Chil Infectol, 2008, 25(2): 14-8. |
| [10] | Yan X, Mohankumar P S, Dietzschold B, et al. The rabies virus glycoprotein determines the distribution of different rabies virus strains in the brain[J]. J Neuro Virol, 2002, 8(4): 345-52. |
| [11] | Marissen W E, Kramer R A, Rice A, et al. Novel rabies virus-neutralizing epitope recognized by human monoclonal antibody: fine mapping and escape mutant analysis[J]. J Virol, 2005, 79(8): 4672-8. doi:10.1128/JVI.79.8.4672-4678.2005 |
| [12] | Lentz T L, Burrage T G, Smith A L, et al. Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor[J]. Science, 1982, 215(4529): 182-4. doi:10.1126/science.7053569 |
| [13] | 付爱玲, 赵保全. 中枢神经系统疾病治疗新技术——蛋白质和核酸的入脑转运[M]. 重庆: 西南师范大学出版社, 2012. Fu A L, Zhao B Q. A new technology for the treatment of central nervous system diseases-protein and nucleic acid into the brain[M]. Chongqing: Southwest China Normal University Press, 2012. |
| [14] | Fu A, Zhao Z, Gao F, et al. Cellular uptake mechanism and therapeutic utility of a novel peptide in targeted-delivery of proteins into neuronal cells[J]. Pharm Res, 2013, 30(8): 2108-17. doi:10.1007/s11095-013-1068-6 |
| [15] | 张苗苗, 张恩齐, 付爱玲, 等. 双功能融合蛋白RDP-BDNF对东莨菪碱所致认知功能障碍小鼠学习记忆的影响[J]. 中国药理学通报, 2014, 30(11): 1569-74. Zhang M M, Zhang E Q, Fu A L, et al. Effect of bifunctional RDP-BDNF fusion protein on ability of learning and memory of cognitive dysfunction mice induced by scopolamine[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30(11): 1569-74. doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2014.11.018 |
| [16] | Wu J, Zhang E, Fu A. A novel cell-permeable RDP-p53 fusion protein for specific inhibition on the growth of cancerous neural cells[J]. Drug Deliv, 2016, 23(7): 2464-70. |
| [17] | Kumer P, Wu H, McBride J L, et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system[J]. Nature, 2007, 448(7149): 39-43. doi:10.1038/nature05901 |
| [18] | Mariana C, Liliana M, Clevio N, et al. Intravenous administration of brain-targeted stable nucleic acid lipid particles alleviates Machado-Joseph disease neurological phenotype[J]. Biomaterials, 2016, 82: 124-37. doi:10.1016/j.biomaterials.2015.12.021 |
| [19] | Jere D, Arote R, Jiang H L, et al. Bioreducible polymers for efficient gene and siRNA delivery[J]. Biomed Mater, 2009, 4(2): 025020. doi:10.1088/1748-6041/4/2/025020 |
| [20] | Sonawane N D, Szoka F C, Verkman A S. Chloride accumulation and swelling in endosomes enhances DNA transfer by polyamine-DNA polyplexes[J]. J Biol Chem, 2003, 278(45): 44826-31. doi:10.1074/jbc.M308643200 |
| [21] | Son S, Hwang D W, Singha K, et al. RVG peptide tethered bioreducible polyethylenimine for gene delivery to brain[J]. J Control Release, 2011, 155(1): 18-25. doi:10.1016/j.jconrel.2010.08.011 |
| [22] | Rapoport S I. Advances in osmotic opening of the blood-brain barrier to enhance CNS chemotherapy[J]. Expert Opin Inv Drug, 2001, 10(10): 1809-18. doi:10.1517/13543784.10.10.1809 |
| [23] | Hwang D W, Son S, Jang J, et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA[J]. Biomaterials, 2011, 32(21): 4968-75. doi:10.1016/j.biomaterials.2011.03.047 |
| [24] | Luo D, Haverstick K, Belcheva N, et al. Poly (ethylene glycol)-conjugated PAMAM dendrimer for biocompatible high-efficiency DNA delivery[J]. Macromolecules, 2002, 35(9): 3456-62. doi:10.1021/ma0106346 |
| [25] | Liu Y, Huang R, Han L, et al. Brain-targeting gene delivery and cellular internalization mechanisms for modified rabies virus glycoprotein RVG29 nanoparticles[J]. Biomaterials, 2009, 30(25): 4195-202. doi:10.1016/j.biomaterials.2009.02.051 |
| [26] | Mao S, Sun W, Kissel T. Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2010, 62(1): 12-27. doi:10.1016/j.addr.2009.08.004 |
| [27] | Dehousse V, Garbacki N, Colige A, et al. Development of pH-responsive nanocarriers using trimethylchitosans and methacrylic acid copolymer for siRNA delivery[J]. Biomaterials, 2010, 31(7): 1839-49. doi:10.1016/j.biomaterials.2009.11.028 |
| [28] | Wang Z H, Wang Z Y, Sun C S, et al. Trimethylated chitosan-conjugated PLGA nanoparticles for the delivery of drugs to the brain[J]. Biomaterials, 2010, 31(5): 908-15. doi:10.1016/j.biomaterials.2009.09.104 |
| [29] | Gao Y, Wang Z Y, Zhang J, et al. RVG-peptide-linked trimethylated chitosan for delivery of siRNA to the brain[J]. Biomacromolecules, 2014, 15(3): 1010-8. doi:10.1021/bm401906p |
| [30] | Choi W I, Kim Y H, Tae G. Controlled release of proteins from pluronic-based nano-carrier[J]. Macromol Res, 2011, 19(6): 639-42. doi:10.1007/s13233-011-0602-9 |
| [31] | Kim J Y, Choi W I, Kim Y H, et al. Brain-targeted delivery of protein using chitosan-and RVG peptide-conjugated, pluronic-based nano-carrier[J]. Biomaterials, 2013, 34(4): 1170-8. doi:10.1016/j.biomaterials.2012.09.047 |
| [32] | Jangwook L, Ju J E, Kyung L Y, et al. Optical imaging and gene therapy with neuroblastoma-targeting polymeric nanoparticles for potential theranostic applications[J]. Small, 2016, 12(9): 1201-11. doi:10.1002/smll.v12.9 |
| [33] | Zhang E, Fu A. A new strategy for specific imaging of neural cells based on peptide-conjugated gold nanoclusters[J]. Int J Nanomed, 2015, 10: 2115-24. |
| [34] | Muthu M S, Kulkarni S A, Xiong J, et al. Vitamin E TPGS coated liposomes enhanced cellular uptake and cytotoxicity of docetaxel in brain cancer cells[J]. Int J Pharm, 2011, 421(2): 332-40. doi:10.1016/j.ijpharm.2011.09.045 |
| [35] | Tao Y, Han J, Dou H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposome: bio-behavioral study[J]. J Mater Chem, 2012, 22(23): 11808-15. doi:10.1039/c2jm31675g |
| [36] | 项松涛, 赵明, 付爱玲, 等. RDP多肽修饰的姜黄素隐形脂质体脑靶向作用的研究[J]. 中国药理学通报, 2015, 31(8): 1136-41. Xiang S T, Zhao M, Fu A L, et al. Brain targeting effect of PEGylated liposomes modified with RDP peptide[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31(8): 1136-41. |