2. 国家中医药管理局重点研究室 (心脑血管络病),河北 石家庄 050035;
3. 国家中医药管理局中医络病学重点学科,河北 石家庄 050035;
4. 河北省络病重点实验室,河北 石家庄 050035
2. Key Laboratory of State Administration of TCM (Cardio-Cerebral Vessel Collateral Diseases), Shijiazhuang 050035, China;
3. Key Disciplines of State Administration of TCM for Collateral Diseases, Shijiazhuang 050035, China;
4. Key Laboratory of Hebei Province for Collateral Diseases, Shijiazhuang 050035, China
动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 病变部位同时存在M1和M2型巨噬细胞,是斑块形成、纤维帽破裂和血栓形成的关键因素[1]。在不稳定斑块中以M1型为主,而在稳定斑块组织中以M2型为主[2]。M1型由于其促炎及组织损伤作用在早期AS形成过程中占主导作用;M2型巨噬细胞,释放抑炎因子,促进斑块纤维帽形成,增强斑块稳定性[3]。Notch信号是巨噬细胞生物学功能的关键调节器,激活Notch信号能促进巨噬细胞向M1型分化,阻断Notch信号后,即使给予M1型诱导因素,巨噬细胞也不能极化为M1型,而是向M2型极化[4]。近来研究表明通心络可以从多方面、多环节发挥抗动脉粥样硬化作用,但尚未见到通心络对于巨噬细胞极化的研究[5]。本实验将就通心络能否通过阻断Notch信号通路活化起到抑制巨噬细胞向M1型极化并减少炎症因子产生的作用。
1 材料与方法 1.1 试剂与主要仪器THP-1细胞 (中国科学院上海细胞库),通心络超微粉 (石家庄以岭药业),RPMI 1640培养基、胎牛血清 (Gibco公司),胰蛋白酶 (Amersco公司),佛波酯 (phorbol myristate acetate, PMA,Sigma公司)、脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS,Sigma公司),人重组IL-4 (美国Peprotech公司),IL-10、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒 (Abcam公司),兔抗人Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1抗体 (Abcam公司),BCA蛋白定量分析试剂盒、细胞核/细胞质蛋白抽提试剂盒 (Pierce公司),分光光度计、多功能酶标仪 (BioTek公司),odyssey扫膜仪 (Li-Cor公司)、显微镜 (Zeiss公司)、转膜仪 (Bio-Rad公司)。
1.2 通心络超微粉溶液的制备参照文献[6]制备通心络超微粉溶液,取适量通心络超微粉溶于无血清RPMI 1640培养基,超声促溶1 h,6500×g离心10 min,收集上清液并用0.22 μm微孔过滤器过滤除菌,离心所得沉淀于60 ℃烘干并称量,以计算和校正所得溶液中药物浓度,于-20 ℃保存备用,用时稀释至目标浓度。
1.3 细胞培养用RPMI 1640培养基培养THP-1细胞,于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养。实验分为5组,取对数生长期的细胞接种于96孔板或6 cm皿中培养,待细胞生长稳定后,分别对各组细胞进行处理。对照组:无血清培养基培养24 h;PMA组:含PMA (5 μg·L-1) 的无血清培养基培养24 h;M2组:含PMA (5 μg·L-1)、mrIL-4 (100 μg·L-1) 的无血清培养基培养24 h;M1组:含PMA (5 μg·L-1)、LPS (200 μg·L-1) 的无血清培养基培养24 h;通心络组:含TXL (300 mg·L-1) 的无血清培养基培养4 h,继而用含PMA (5 μg·L-1)、LPS (200 μg·L-1)、TXL (300 mg·L-1) 的无血清培养基培养24 h。收取各组细胞培养上清或蛋白用于指标检测。
1.4 倒置显微镜观察巨噬细胞形态变化将各组THP-1细胞进行相应处理后,置于倒置显微镜下拍照观察。
1.5 ELISA法检测细胞培养上清中M2型巨噬细胞标志分子IL-10、M1型巨噬细胞标志分子IL-6、TNF-α的水平将各组细胞进行相应处理后,收集细胞培养上清,按照各指标试剂盒所附操作方法检测细胞培养上清中IL-6、IL-10、TNF-α的水平。
1.6 Western blot法检测细胞目的蛋白表达将各组THP-1细胞进行相应处理后,提取各组细胞蛋白,用BCA蛋白定量分析试剂盒进行蛋白定量。Western blot法检测Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1蛋白表达。用Odyssey扫膜仪对结果进行半定量分析,以β-actin作为内参,以目的蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值表示检测样品中目的蛋白的相对含量进行数据统计。
1.7 统计学处理计量资料以x±s表示,应用SPSS19.0统计软件进行数据分析。首先进行正态性检验和方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析,方差齐同,采用LSD方法;方差不齐,用Dunnett T3方法进行方差分析;不符合正态分布,采用非参数检验进行分析。
2 结果 2.1 巨噬细胞形态变化THP-1细胞为悬浮细胞,经PMA诱导后发生贴壁,PMA、IL-4诱导的THP-1细胞伪足伸展;PMA、LPS诱导的THP-1细胞形态狭长。其形态特征的差异可能是由于M2型巨噬细胞有较强的吞噬功能。见Fig 1。
2.2 细胞培养上清中IL-10、IL-6、TNF-α、水平ELISA结果显示,Control组与PMA组比较,IL-10、IL-6、TNF-α的水平差异无统计学意义,说明实验浓度的PMA对巨噬细胞极化表型没有影响。与对照组比较,M1组IL-6、TNF-α水平明显升高 (P < 0.01);M2组IL-10水平升高 (P < 0.01),IL-6、TNF-α的水平差异无统计学意义;说明M2和M1型巨噬细胞模型建立成功。与M1组比较,在M1型诱导因素存在的情况下,TXL组IL-6、TNF-α的水平明显降低 (P < 0.01),说明TXL可以抑制LPS诱导的巨噬细胞向M1型极化。见Tab 1。
Group | IL-10/pg·L-1 | IL-6/pg·L-1 | TNF-α/pg·L-1 |
Control | 47.29±1.36 | 7.40±0.22 | 16.82±2.25 |
PMA | 37.89±1.88 | 7.74±0.47 | 20.44±1.33 |
M2 | 105.14±1.44 | 4.98±0.44 | 27.06±2.06 |
M1 | 9.86±0.83**## | 98.51±0.66**## | 265.64±2.42**## |
TXL | 44.03±2.05△△ | 37.31±0.87△△ | 122.02±2.79△△ |
**P < 0.01 vs control;△△P < 0.01 vs M1;##P < 0.01 vs M2 |
Western blot结果显示,Control组与PMA组比较,Notch-1、active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表达差异无统计学意义,可以排除实验浓度的PMA对Notch信号通路产生的影响。与对照组和M2组比较,M1组Notch-1蛋白表达差异无统计学意义,active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表达明显升高 (P < 0.01);与M1组比较,TXL组active Notch-1、DLL4、Hes-1的蛋白表达明显降低 (P < 0.01);说明TXL可以抑制LPS诱导的巨噬细胞Notch信号通路的活化。见Fig 2。
3 讨论单核/巨噬细胞在AS发生发展过程中发挥极其重要的作用。研究表明,AS病变部位同时存在M1型和M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞分泌较多的炎症因子而促进AS的发展;M2型高表达抑炎因子而促进组织修复和稳定斑块[3],而且M2型巨噬细胞在斑块逆转过程中发挥重要作用,在斑块逆转动物模型中观察到了M2型巨噬细胞相关标志基因高表达[7]。炎症是血管内皮的重要损伤因素,而血管内皮的损伤又是AS发生发展的重要环节。因此抑制M1型巨噬细胞的形成有助于防止AS的发生发展。
采用PMA分别联合IL-4、LPS建立M2型和M1型巨噬细胞模型[8]。观察到PMA可以诱导悬浮的THP-1细胞贴壁,LPS诱导的巨噬细胞形态狭长,伪足较少;IL-4诱导的巨噬细胞形态不规则有较多的伪足,可能与M2型巨噬细胞具有较强的吞噬功能有关[9]。LPS诱导的巨噬细胞高表达M1型标志分子IL-6和TNF-α,低表达M2型标志分子IL-10;而IL-4诱导的巨噬细胞高表达IL-10,低表达IL-6和TNF-α,表明M1和M2型巨噬细胞极化模型的成功建立。在M1型巨噬细胞诱导因素存在的条件下,通心络可以抑制巨噬细胞IL-6和TNF-α的表达,上调IL-10的表达,表明通心络可以抑制巨噬细胞向M1型极化。采用Notch信号抑制剂GSI作用于LPS诱导的巨噬细胞,发现GSI可以通过转录后调节的方式下调TNF-α的蛋白表达,而对IL-10 mRNA有上调作用,对IL-6 mRNA有下调作用[10]。通心络的作用与Notch信号抑制剂GSI的作用具有一致性,因此,有理由推测通心络抑制巨噬细胞向M1型极化的作用可能涉及到Notch信号通路的参与。
Notch信号通路是巨噬细胞生物学功能的关键调节器,激活Notch信号可促进巨噬细胞向M1型极化[4]。LPS是TLR4受体激动剂,是诱导巨噬细胞向M1型极化的经典因素,可以通过MyD88依赖或非依赖的途径上调巨噬细胞Notch-1的表达,活化Notch下游基因Hes1和Deltex的表达。NF-κB信号通路是Notch信号通路调节巨噬细胞促炎症反应的主要通路,LPS可以引起NF-κBp50和NF-κBp65核转位增强,而应用GSI或敲除Notch信号的方式阻断Notch信号通路可以明显抑制p50的核转位而对p65的核转位没有影响。LPS可以剂量-时间依赖性的促进单核细胞DLL4 mRNA和蛋白的表达,沉默TLR4基因或使用NF-κB抑制剂SN50可抑制DLL4 mRNA的表达[11]。本研究实验结果显示,IL-4诱导的M2组巨噬细胞Notch-1及其活化形式active Notch-1、配体DLL4及下游关键转录因子Hes-1表达与对照组比较无明显变化;而LPS刺激可以促进巨噬细胞Notch信号通路的活化,上调active Notch-1、DLL4和Hes-1的蛋白表达;应用通心络可以抑制LPS刺激引起的巨噬细胞active Notch-1、DLL4和Hes-1的蛋白表达。实验结果表明,通心络可以通过抑制Notch信号的活化,抑制LPS诱导的巨噬细胞向M1型极化,减少炎症因子的表达。
Notch信号途径是复杂的信号网络,多种Notch受体和配体同时存在且多种胞内和胞外蛋白可以通过不同的机制调控Notch信号;Notch信号在激活后还可以触发其他信号途径。Notch信号通路与其他调节巨噬细胞极化的信号通路具有广泛的网络联系,如Toll样受体 (TLRs),干扰素调节因子 (interferon regulatory factor, IRF)、NF-κB、MAPK和JAK/STAT信号通路。多种影响Notch信号的复杂因素在整个信号传导过程中相互联系,使得Notch信号成为复杂的信号网络[12]。对于通心络如何作用于Notch信号通路及其作用是否涉及其他通路将进行进一步研究。
( 致谢: 本实验于河北省络病重点实验室完成! )
[1] | Mangge H, Becker K, Gostner J M. Antioxidants, inflammation and cardiovascular disease[J]. World J Cardiol, 2014, 6 (6): 462-77. doi:10.4330/wjc.v6.i6.462 |
[2] | Quillard T, Charreau B. Impact of notch signaling on inflammatory response in cardiovascular disorders[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14 (4): 6863-88. doi:10.3390/ijms14046863 |
[3] | Chen F Y, Zhou J, Guo N, et al. Curcumin retunes cholesterol transport homeostasis and inflammation respose in M1 macrophage to prevent atherostasis[J]. Biocherm Biophys Res Commun, 2015, 15 (10): 1-7. |
[4] | Singla R D, Wang J, Singla D K. Regulation of Notch 1 signaling in THP-1 cells enhances M2 macrophage differentiation[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2014, 307 (11): H1634-42. doi:10.1152/ajpheart.00896.2013 |
[5] | 李红蓉, 张肖, 常丽萍, 等. 通心络胶囊抗动脉粥样硬化研究进展[J]. 中成药, 2016, 38 (2): 386-91. Li H R, Zhang X, Chang L P, et al. The research progression on anti-atherosclerosis of Tongxinluo[J]. Chin Tradit Patent Med, 2016, 38 (2): 386-91. |
[6] | Cui H H, Li X D, Li N, et al. Induction of autophagy by tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2014, 64 (2): 180-90. doi:10.1097/FJC.0000000000000104 |
[7] | 王姗, 孙桂波, 罗云, 孙晓波. 动脉粥样硬化斑块逆转的研究进展[J]. 中国药理学通报, 2016, 32 (8): 1059-63. Wang S, Sun G B, Luo Y, Sun X B. Advanced research progress on atherosclerosis plague regression[J]. Chin Pharmacol Bull, 2016, 32 (8): 1059-63. |
[8] | Zhang F, Liu H, Jiang G, et al. Changes in the proteomic profile during the differential polarization status of the human monocyte-derived macrophage THP-1 cell line[J]. Proteomics, 2015, 15 (4): 773-86. doi:10.1002/pmic.201300494 |
[9] | Horckmans M, Ring L, Duchene J, et al. Neutrophils orchestrate post-myocardial infarction healing by polarizing macrophages towards a reparative phenotype[J]. Eur Heart J, 2017, 38 (3): 187-97. |
[10] | Palaga T, Buranaruk C, Rengpipat S, et al. Notch signaling is activated by TLR stimulation and regulates macrophage functions[J]. Eur J Immunol, 2008, 38 (1): 174-83. doi:10.1002/(ISSN)1521-4141 |
[11] | Fung E, Tang S M, Ganner J P, et al. Delta-like 4 induces notch signaling in macrophages:implications for inflammation[J]. Circulation, 2007, 115 (23): 2948-56. doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.106.675462 |
[12] | Shang Y, Smith S, Hu X. Role of Notch signaling in regulating innate immunity and inflammation in health and disease[J]. Protein Cell, 2016, 7 (3): 159-74. doi:10.1007/s13238-016-0250-0 |