2. 暨南大学生命科学技术学院，细胞生物学系，广东 广州 510632
2. Dept of Cell Biology, College ofLife Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
病原微生物感染，首先启动的是简并识别的固有免疫系统，其中吞噬细胞起着关键作用。吞噬细胞表面或细胞内部的模式识别受体 (pattern recognition receptor, PRR)，识别病原相关分子模式 (pathogen-associated molecular pattern, PAMP)，如革兰阴性菌的脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)，启动炎症反应，包括激活NF-κB信号通路，上调肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β前体 (pro-interleukin-1β, pro-IL-1β, 31 ku) 等炎症细胞因子的表达；并能进一步激活炎症小体和caspase-1[1]，使pro-IL-1β剪切成为成熟的IL-1β(17 ku)。激活炎症小体是机体最重要的固有免疫防御机制之一，包括：激活半胱氨酸天冬氨酸酶-1/-11(caspase-1/-11)，剪切pro-IL-1β、gasdermin D等，促进IL-1β等炎症因子成熟和释放[2]。然而，最近有研究表明，成熟IL-1β只有在细胞死亡时才会被释放到细胞外[3]。与成熟IL-1β释放相关的细胞死亡可以通过PAMP (如：核酸、脂蛋白和LPS) 首先激活巨噬细胞，然后以ATP或其他内源性损伤相关分子模式 (danger-associated molecular patterns, DAMPs)(如尿酸钠晶体) 刺激来诱导其发生；这种细胞死亡方式伴随着炎症小体和caspase-1的活化 (产生caspase-1 p10活性片段)，称之为细胞焦亡。细胞焦亡的特征表现为细胞膜孔的快速形成 (碘化丙锭等细胞核染料可籍此进入细胞)，从而导致细胞内炎症物质的释放和细胞破裂，而有研究表明caspase-1的活化可以增加细胞内钙离子水平和细胞膜的通透性，从而有利于成熟IL-1β、HMGB1以及其他内容物通过溶酶体胞吐作用释放到胞外[4]。
二甲双胍 (metformin) 是一种用于治疗2型糖尿病的一线药物，许多研究也表明二甲双胍不仅能通过改善代谢参数，如高血糖、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、血脂异常等来改善慢性炎症，同时具有直接的抗炎作用[5]。为了探索二甲双胍药物对急性炎症条件下发生的细胞焦亡和IL-1β释放的影响，本研究利用LPS作为PAMP活化腹腔巨噬细胞，以ATP作为DAMP激活炎症小体并诱导细胞焦亡的发生，探讨了二甲双胍对巨噬细胞的细胞焦亡、caspase-1活化和成熟IL-1β释放的影响。
1 材料与方法 1.1 实验材料C57BL/6小鼠，♀，6~8周龄，体质量 (20.0±2.0) g，购于南方医科大学实验动物中心。细菌脂多糖 (LPS)、三磷酸腺苷 (ATP)、碘化丙锭 (propidium iodide, PI)、Hoechst 33342、Tween-80、兔抗P2X7嘌呤能受体7抗体等购于Sigma-Aldrich公司。巯基乙酸盐 (thioglycolate, TG) 购自Becton Dickinson公司。DMEM、胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)、青霉素、链霉素、L-谷氨酰胺为Gibco/Invitrogen公司的产品。二甲双胍 (metformin) 购买于Beyotime公司。抗β-tubulin、IL-1β、caspase-1等抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗购买于Cell Signaling Technology公司。AlexaFluor488-CD11b购自eBioscience公司。
1.2 实验仪器SDS-PAGE电泳系统 (美国Bio-Rad公司MINI Protean2)；Zeiss荧光倒置显微镜 (德国Zeiss公司，Axio Observer D1)；Alpha化学发光凝胶成像系统 (美国Alpha Innotech，FluorChem 8000)。
1.3 细胞培养C57BL/6小鼠腹腔注射500 μL 30 g·L-1 TG溶液，4 d后，断颈处死，用含50 mL·L-1 FBS和0.5 mmol·L-1 EDTA的PBS洗出小鼠腹腔液，300×g离心10 min，重悬于完全培养基中 (含青霉素100 000 U·L-1、链霉素100 mg·L-1、L-谷氨酰胺25 mmol·L-1、100 mL·L-1 FBS)。在37℃，5% CO2培养箱中培养2 h后，洗去非贴壁细胞，换成新鲜的完全培养基，剩下的贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞，将其在培养箱中培养过夜。
1.4 细胞焦亡检测参考前文[6]方法，简述如下：将30 g·L-1 TG诱导产生的腹腔巨噬细胞接种在24孔板中。过夜后，加入二甲双胍处理1 h，其浓度从低到高依次为0.22、0.67、2 mmol·L-1，接着用0.5 mg·L-1的LPS诱导4 h，然后加入2 mmol·L-1 ATP刺激30 min，最后PI和Hoechst 33342双染色10 min，置于蔡司倒置荧光显微镜下观察并拍照。
1.5 免疫印迹法将30 g·L-1 TG诱导产生的腹腔巨噬细胞接种在6孔板中，分成9组；先用0.5 mg·L-1的LPS诱导4 h，然后二甲双胍 (0.22、0.67、2 mmol·L-1) 处理1 h，最后加入2 mmol·L-1 ATP刺激30 min；分别提取细胞和上清 (各样品等体积) 中的总蛋白，对细胞裂解液中的蛋白进行定量；分别进行SDS-PAGE电泳，将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上，用封闭液 (含50 g·L-1脱脂奶粉和1 mL·L-1 Tween-20的PBS溶液) 封闭1 h，一抗在4℃摇床孵育过夜，然后辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1 h，碧云天公司的BeyoECL Plus化学发光试剂盒显色，X光片显影。最后用FluorChem 8000成像仪记录结果，用AlphaEaseFC软件进行条带灰度分析。
1.6 免疫荧光分析参考前文[7]方法，简述如下：将30 g·L-1 TG诱导产生的腹腔巨噬细胞接种在玻底培养皿中，LPS和二甲双胍的处理方法同上。最后吸弃其培养基，每孔加1 mL 40 g·L-1多聚甲醛，室温固定15 min，然后每孔加2 mL冷甲醇于-20℃条件下通透10 min，再用封闭液室温封闭1 h，加一抗 (100 μL每孔，其中P2X7R为1 :100，AlexaFluor488-CD11b为1 :50)，4℃孵育过夜，洗涤后加无交叉反应的CF568-山羊抗兔IgG (美国Biotium公司)，室温孵育1 h，Hoechst 33342染核10 min并避光，蔡司荧光显微镜观察，拍照。
1.7 统计学分析数据以x±s表示，用GraphPad Prism 4.0软件进行单因素方差分析，多组间比较采用Tukey检验。
2 结果 2.1 二甲双胍促进ATP诱导的腹腔巨噬细胞的细胞焦亡在本实验中，采用文献常用的LPS+ATP处理诱导细胞焦亡，PI染色用于指示焦亡的细胞[8]。结果表明，LPS和二甲双胍本身不能诱导腹腔巨噬细胞发生焦亡 (Fig 1A)。ATP可刺激LPS激活的腹腔巨噬细胞发生焦亡，且二甲双胍处理，可明显促进LPS+ATP诱导的细胞焦亡并具有量效关系 (Fig 1B, 1C)。从细胞形态上，加入ATP之后，细胞膜明显变圆肿胀，甚至破裂成细胞碎片。PI染料可穿过细胞膜进入核内，发出红色荧光。上述结果表明，二甲双胍可剂量依赖性地促进ATP诱导的巨噬细胞焦亡。
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| Fig 1 Metformin promotes cell pyroptosis of TG-elicited peritoneal macrophages induced by LPS+ATP (n=4) A & B: Fluorescence images of TG-elicited peritoneal macrophages stained with propidium iodide (PI)(red) and Hoechst 33342(blue) dyes. The insets showed one of the PI-positive (pyroptotic) cells.C:Statistical analysis of the ratios of pyroptotic cells (PI-positive) in each group; **P < 0.01 vs LPS+ATP group |
文献提示，细胞焦亡伴随着炎症小体和caspase-1的活化以及成熟的IL-1β(17 ku) 的释放[3]。由于ATP诱导细胞焦亡，因此本研究通过免疫印迹法从蛋白表达水平上分析二甲双胍对LPS+ATP处理的腹腔巨噬细胞表达IL-1β及其他炎症小体活化标志性蛋白caspase-1活化的影响。结果显示，单独LPS刺激可促进腹腔巨噬细胞pro-IL-1β(31 ku) 的表达，但不影响腹腔巨噬细胞内pro-caspase-1(45 ku) 的表达水平 (Fig 2A, cell lysates)，而且细胞培养上清中未检测到活化的caspase-1p10(10 ku) 和成熟的IL-1β(17 ku) 释放 (Fig 2A, supernatant，所有样品来自等体积的细胞培养上清)。当细胞加入第二信号ATP刺激后，细胞培养上清中可明显检出被细胞释放的活化的caspase-1p10(10 ku) 和成熟的IL-1β(17 ku)(Fig 2A, 2B, 2C, supernatant)。二甲双胍处理可进一步促进上述ATP诱导的巨噬细胞释放活化的caspase-1p10(10 ku) 和成熟的IL-1β(17 ku) 蛋白，并具有明显的量效关系；但如果没有ATP的刺激，二甲双胍本身 (或与LPS联合) 不能促进活化的caspase-1和成熟的IL-1β的释放水平 (Fig 2A, 2B, 2C, supernatant)。因此，上清中活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的释放水平，可能与细胞焦亡率密切相关。这一点与上述细胞焦亡检测结果以及前人发表的文献相符[3]。值得一提的是，细胞裂解液中只检测到pro-caspase-3(35 ku) 的表达，而没有检测到活化的caspase-3(17、19 ku) 的表达水平 (Fig 2A, cell lysates)，说明细胞凋亡 (一种依赖caspase-3的细胞死亡方式) 可能未参与上述活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的释放过程。
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| Fig 2 Metformin promotes release of IL-1β and caspase-1 p10 from TG-elicited peritoneal macrophages induced by LPS+ATP stimulation (n=3) A:Western blot bands of proteins from the supernatants and cell lysates, respectively; Total proteins in the supernatant of each group came from an equal volume of supernatant of equal cell numbers. B & C: The relative gray levels of the Western blot bands of caspase-1 p10(B) and mature IL-1β(C) from respective cell culture supernatants, setting the gray-scale value of (LPS+ATP) bands as 1, respectively. *P < 0.05, **P < 0.01 vs LPS+ATP group |
上述结果中发现二甲双胍可促进LPS+ATP诱导的腹腔巨噬细胞发生焦亡，并伴随成熟IL-1β和活化caspase-1p10的释放。有趣的是，机体受细菌感染后可释放ATP，胞外ATP经细胞膜上的受体介导，尤其是P2X7R，导致K+的释放和炎症小体的活化[9]，提示二甲双胍促进炎症反应和细胞焦亡可能与上调ATP受体P2X7R的表达有关。结果如Fig 3(A, B)所示，经2 mmol·L-1二甲双胍处理的LPS激活的腹腔巨噬细胞的细胞膜上P2X7R的荧光强度明显大于对照组和单独LPS处理组的荧光强度。这表明，二甲双胍可能是通过上调P2X7R在细胞膜上的表达来促进细胞焦亡以及成熟IL-1β和活化caspase-1p10的释放。
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| Fig 3 Metformin increases membranous immunofluorescenceintensity indicating redistribution of P2X7R (n=100) A:Immunofluorescence images of P2X7R (red) and CD11b (green, cell membrane marker of peritoneal macrophages); the nuclei were revealed by Hoechst 33342 staining (blue) and the merged images of P2X7R, CD11b and nuclei were also shown. B:Statistical analysis of the mean fluorescence intensities of P2X7R on cell membranes. **P < 0.01 vs control |
LPS是革兰阴性菌表达的PAMP，可被Toll样受体4(TLR4) 或细胞内的caspase-11识别[10]。LPS与TLR4结合后，可以激活炎症信号通路，上调pro-IL-1β和炎症小体组分NLRP3等蛋白的表达；当以ATP为第二信号刺激后，引起NLRP3炎症小体的组装，激活caspase-1的活化 (形成具有蛋白酶活性的caspase-1p10片段并释放到胞外)，促进IL-1β的成熟，并在细胞膜上形成孔洞，使成熟的IL-1β等炎症因子得以释放[3]。因此，活化的caspase-1p10和成熟的IL-1β的释放，可作为巨噬细胞炎症小体激活的标志。多项研究表明，caspase-1/-11的表达及其介导的炎症因子释放和细胞焦亡，有利于抑制感染 (包括葡聚糖硫酸钠DSS诱导的小鼠急性肠炎)，加快组织修复[11-12]。细胞焦亡有利于胞内致病菌的释放，并被其他吞噬细胞所吞噬、杀伤而清除，防止致病菌在胞内的繁殖和持续存在[13]。因此，增强感染部位的炎症小体的活化和感染细胞 (或被激活细胞) 的焦亡，可能有利于加强局部炎症反应，加速清除致热源 (病原微生物及其PAMP所激活的固有免疫细胞)、促进损伤组织的修复和疾病的痊愈。另一方面，细胞焦亡是活化巨噬细胞的重要退出机制之一；如果巨噬细胞持续激活而不发生焦亡，其免疫代谢通路已经发生改变，导致脂类沉积，成为泡沫细胞或脂肪巨噬细胞，这些细胞持续不断地分泌炎症因子和趋化因子，募集其他免疫细胞至病灶组织，将增加动脉粥样硬化和肥胖症等慢性炎症性疾病的风险[14]。本研究发现，二甲双胍可以促进LPS激活的腹腔巨噬细胞在ATP刺激下导致的细胞焦亡以及成熟IL-1β的释放。有趣的是，介导IL-1β成熟的蛋白酶caspase-1p10(活性形式) 的释放量亦随之增加。也就是说，二甲双胍可增强ATP诱导的腹腔巨噬细胞的炎症小体的活化及其信号通路。该结果提示，二甲双胍可用于增强感染部位的炎症反应，促进被感染细胞 (或被激活细胞) 发生焦亡，从而清除病灶中的活化细胞，防止其因细胞长期存活而持续释放炎症细胞因子，降低慢性炎症性疾病 (如动脉粥样硬化和肥胖) 的风险。
然而，全身性感染 (败血症) 可引起多器官功能衰竭，因感染而诱发的细胞焦亡可能是器官功能衰竭的原因之一[15-16]。由于多器官功能衰竭进程非常迅速，机制尚不明确，目前尚无特异性的治疗办法。在这种情况下，防止细胞焦亡可能是防止败血症病人多器官功能衰竭的关键。二甲双胍可以促进ATP诱导的巨噬细胞发生焦亡，提示在机体受到严重感染 (包括败血症) 的情况下，2型糖尿病患者不宜服用二甲双胍。
本研究发现，二甲双胍促进ATP诱导的腹腔巨噬细胞发生焦亡，可能与其上调ATP受体在细胞膜上的分布有关。由于细胞焦亡的发生非常迅速 (30 min以内)，ATP受体如何通过快速重分布而增强ATP诱导细胞焦亡的作用，需要更多的实验数据才能明确。另外，二甲双胍有多种生物学效应，包括上调AMPK的活性，其促进细胞焦亡效应是否与此有关，也需要更多的实验证据支持。深入研究上述问题，可扩展二甲双胍的临床用途，如用于增强局部炎症小体的激活，促进细胞焦亡，从而快速清除感染病灶，去腐生肌，防止发展为迁延性的慢性炎症性疾病；也有利于更好地指导糖尿病患者合理服用二甲双胍。
( 致谢: 本论文实验在暨南大学生命科学技术学院免疫生物学系完成。魏红霞、李陈广负责动物饲养、细胞培养和药物处理等工作；徐丽慧、梁译丹参与了动物腹腔巨噬细胞的诱导和培养实验；徐丽慧、潘浩参与了免疫荧光实验；欧阳东云教授、何贤辉教授参与了实验设计、实验指导等工作。 )
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