课题组前期发现,黄芩苷、栀子苷 (7 :3) 配伍具有抗脑缺血作用[1-2]。本实验进一步考察黄芩苷、栀子苷 (7:3) 配伍对脑缺血/再灌注损伤大鼠AQP-4、P-gp影响,探讨黄芩苷、栀子苷配伍对脑缺血/再灌注损伤的血脑屏障通透性和脑水肿的影响及作用机制。
1 材料与方法 1.1 药品与试剂黄芩苷 (陕西中鑫生物技术有限公司,批号140821);栀子苷 (陕西维奥生物技术有限公司, 批号140912)。氯丙烯 (上海兴光化学有限公司);伊文斯兰 (美国Sigma公司);P-gp、Na+、K+-ATP酶Elisa试剂盒 (南京建成生物工程研究所),葡萄糖、丙酮酸和乳酸生化试剂盒 (南京建成生物工程研究所),AQP-4一抗体,二抗 (Chemicon公司,批号:BA1560)。
1.2 仪器酶标仪 (美国Bio-TEK公司) 等。
1.3 动物分组与给药SD大鼠,♂,体质量280~320 g,[第四军医大学医院实验动物中心,合格证号SCXK-(军)2012-0007]。大鼠随机分为假手术组、模型组、栀子苷+黄芩苷大、小剂量组 (18+42) mg·kg-1、(9+21) mg·kg-1,氯丙烯组 (1 g·L-1),假手术组和模型对照组给予等体积的4%的吐温溶液,其余各组药物用4%的吐温溶解灌胃给药,连续7 d。
1.4 脑缺血/再灌注损伤模型建立末次给药30 min以后,采用线拴法复制大鼠大脑中动脉脑缺血/再灌注模型 (MCAO)[3]。
1.5 指标测定 1.5.1 脑含水量测定大鼠再灌注24 h断头取脑,从损伤区前缘取200 mg左右脑组织,计算脑水含量/%=(湿重-干重)/湿重×100%。
1.5.2 脑组织中的EB水平检测参照文献[4],脑缺血/再灌注损伤大鼠尾静脉注射EB-PBS液,检测脑组织中的EB水平。
1.5.3 脑组织中P-gp含量和Na+、K+-ATP酶活力测定大鼠于缺血2 h/再灌22 h后断头取脑,去掉嗅球、小脑和低位脑干,将患侧大脑在冰上按1 :9生理盐水制成10%的组织匀浆,离心后取上清液,按照试剂盒说明书测定。
1.5.4 血清葡萄糖、丙酮酸和乳酸含量测定脑缺血/再灌注损伤大鼠于缺血2 h/再灌22 h后,取血清,按试剂盒说明书操作。
1.5.5 脑组织切片制备及HE染色缺血2 h/再灌注22 h,麻醉并4%多聚甲醛大鼠,取脑,固定、石蜡包埋,HE染色。
1.5.6 脑组织内AQP-4表达的检测应用免疫组织化学染色检测脑组织中不同部位AQP-4蛋白的表达。假手术组脑组织作为对照。阳性部位为细胞膜,棕黄色为阳性表达。
1.6 统计学方法结果以x±s表示,应用SPSS,采用F检验比较组间数据差异的显著性。
2 结果脑缺血模型组脑含水量、Na+,K+-ATP酶活力、EB、葡萄糖、丙酮酸、乳酸、P-gp含量明显升高 (P < 0.01,P < 0.05),同时缺血大脑皮层AQP-4阳性表达增强;病理结果显示模型组缺血区出现形态结构不清、血管腔受压变形、组织疏松、细胞体积增大及明显水肿,细胞空泡样变,神经元胞核破碎、结构消失。黄芩苷、栀子苷配伍能明显降低脑含水量、Na+,K+-ATP酶活力、EB、葡萄糖、丙酮酸、P-gp含量 (P < 0.05),下调AQP-4表达,并能明显改善脑组织损伤。结果见Tab 1~3。
Group | Dose /mg·kg-1 |
EB content /μg·g-1 |
Cerebral water content/% |
Sham | 13.05±1.58** | 30±20* | |
Model | 16.20±1.34 | 60±60 | |
Baicalin+Geniposides | 21+9 | 13.78±3.36 | 50±20 |
42+18 | 13.23±2.23* | 40±10* | |
Chloropropene | 0.20 | 13.94±1.43* | 50±10 |
*P < 0.05,**P < 0.01 vs model |
Group | Dose /mg·kg-1 |
P-gp /mg·g-1 |
Na+, K+-ATP /10 U·g-1 |
Sham | 7.53±2.86* | 1.15±0.25* | |
Model | 11.74±2.46 | 0.66±0.31 | |
Baicalin+Geniposides | 21+9 | 8.46±2.28* | 0.95±0.24 |
42+18 | 8.09±1.67** | 1.03±0.19* | |
Chloropropene | 0.20 | 8.23±2.26* | 0.98±0.19* |
*P < 0.05,**P < 0.01 vs model |
Group | Dose /mg·kg-1 |
Glucose /mmol·L-1 |
Pyruvic acid /mmol·L-1 |
Lactic acid /mmol·L-1 |
Sham | 6.88±1.58* | 0.29±0.07** | 31.04±10.04* | |
Model | 11.22±3.91 | 0.53±0.15 | 48.26±17.17 | |
Baicalin+Geniposides | 21+9 | 8.30±2.23 | 0.35±0.09* | 37.09±12.42 |
42+18 | 7.50±1.68* | 0.31±0.12* | 33.50±10.39 | |
Chloropropene | 0.20 | 7.57±1.89* | 0.36±0.10* | 38.00±11.70 |
*P < 0.05, **P < 0.01 vs model |
已知AQP-4升高星形胶质细胞足突肿胀,血脑屏障通透性增加,促发明显的脑水肿和梗死[5]。P-gp是血脑屏障处重要的药物转运蛋白,脑缺血时,P-gp表达明显增加,增加BBB通透性[6]。脑组织缺血缺氧时,葡萄糖进行无氧酵解,乳酸增多,细胞膜上Na+,K+-ATP酶活性降低,细胞内液呈高渗状态,产生细胞毒性脑水肿。课题组发现黄芩苷、栀子苷配伍具有防治脑缺血/再灌注疗效[7]。本实验探讨黄芩苷、栀子苷配伍对CIRI后P-gp、葡萄糖无氧酵解及AQP-4蛋白表达的影响,阐释其降低BBB通透性,发挥防治脑水肿的作用机制。
脑缺血模型组大鼠脑含水量、EB通过量、P-gp含量、AQP-4蛋白表达明显升高,显示出缺血性损伤BBB通透性明显增强;缺血区细胞形态不清,有细胞体积增大、水肿,神经元胞核破碎、结构消失;Na+,K+-ATP酶活力降低、葡萄糖、丙酮酸及乳酸含量升高,显示出脑缺血损失时,无氧呼吸明显增强,细胞毒性明显。可见,黄芩苷、栀子苷 (7 :3) 配伍可能通过提高Na+,K+-ATP酶活性,降低脑组织无氧呼吸,减轻细胞毒性;降低P-gp含量、AQP-4蛋白表达,改善BBB通透性,减轻脑水肿损伤,从而起到防治脑缺血/再灌注损伤的作用。但其体内调控的机制仍需进一步深入研究。
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[2] | 李敏, 王斌, 唐志书, 等. 黄芩苷、栀子苷对大鼠脑缺血保护作用的机制[J]. 中药药理与临床, 2012, 28 (3): 34-6. Li M, Wang B, Tang Z S, et al. Mechanism of Baicalin and Geniposide on blood brain barrier permeability in cerebral ischemia reperfusion injury rats[J]. Pharmacol Clin Chin Mat Med, 2012, 28 (3): 34-6. |
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