2. 延边大学医学部细胞功能研究中心，生理学与病理生理学教研室，吉林 延吉 133000
2. Cellular Function Research Center, Dept of Physiology and Pathophysiology, College of Medicine, Yanji Jilin 133000, China
依托咪酯 (etomidate，ET) 是一种作用强、短效的非巴比妥类静脉麻醉药，常用于麻醉诱导和门诊手术麻醉。研究表明，ET可直接或间接作用于丘脑皮层神经元GABAA受体，产生GABA样的作用，或增强GABA与GABAA受体结合所引起的效应，减少神经元动作电位的发生频率[1]。ET明显抑制初级感觉皮层锥体细胞电压门控Na+通道，减小Na+电流，提示ET可能通过抑制初级感觉皮层神经元Na+通道，降低神经元兴奋性[2]，而ET影响小脑皮层神经元功能的文献尚未见报道。小脑浦肯野细胞 (purkinje cell，PC) 是小脑皮质的主要神经细胞，其轴突构成小脑皮质的唯一的传出路径。因此，研究ET对小脑皮层自发性放电活动，是进一步研究ET与小脑功能的基础，也为深入阐明静脉麻醉药对中枢神经系统的分子作用机制提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 动物与试剂健康ICR小鼠15只，6~8周龄，♀♂不拘，体质量28 g~32 g，由延边大学实验动物中心提供。依托咪酯和人工脑脊液 (ACSF)。
1.2 仪器美国产Axopatch-200B膜片钳放大器、1440AD/DA转换器、Clampex 10.3数据采集与分析软件及MP-285微操纵器。膜片钳专用显微镜 (Nikon Eclipse E-600FN, Japan) 与体视显微镜 (Nikon, 日本) 等。
1.3 动物模型的制备腹腔注射乌拉坦1.3 g·kg-1进行麻醉，待角膜反射消失后行气管切开，并置入自制气管导管妥善固定，然后将小鼠置于特制的脑立体定位仪上，用双侧耳棒固定头部，在小脑行开颅手术，开孔直径约为1.0~1.5 mm，除去硬脑膜后暴露Vermis Vla/Vlb区，将小鼠和脑立体定位仪同时固定在显微镜下，确定需要记录的部位后进行电生理记录。手术暴露脑表面部位采用蠕动泵持续脑表面灌流含95% O2+5% CO2混合气体的人工脑脊液。在整个手术和电生理记录过程中，使用体温恒温仪和加热垫将小鼠体温维持在 (37.0±0.2)℃。
1.4 PC放电记录浦肯野细胞贴附式记录使用Multiclamp700B放大器，通过D/A转换器1440和Clampfit 10.3软件获取浦肯野细胞自发性活动数据。待自发放电活动稳定后开始记录，观察ET对小鼠小脑皮层PC自发性单纯放电频率影响浓度依赖性时，用7只ICR小鼠，脑表面ET 5、50、100、300 μmol·L-1，各灌流10 min，每次药物浓度增加之前，需用人工脑脊液冲洗30 min；观察ET对小鼠小脑皮层浦肯野细胞自发放电活动时，用8只ICR小鼠，脑表面灌流300 μmol·L-1。在细胞贴附式记录条件下，浦肯野细胞是通过其独特的自发性单纯峰电位和复杂峰电位放电模式来认定的。
1.5 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料采用x±s表示，不同浓度ET间放电频率和小穗数量的比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 ET降低PC的SS的放电频率并具有浓度依赖性小脑表面灌流5 μmol·L-1的ET浦肯野细胞SS放电频率并没有产生明显的影响 (P＞0.05)，50、100 μmol·L-1的ET对PC的SS放电率与对照组相比明显抑制分别为 (41.02±6.25)%、(72.45±6.46)%(P＜0.05)，300 μmol·L-1ET完全抑制浦肯野细胞的SS放电 (P < 0.05)，50%的抑制浓度 (IC50) 为62.91 μmol·L-1。结果显示小脑表面给予ET降低浦肯野细胞单纯峰电位的放电频率，其抑制作用具有浓度依赖性。
2.2 ET对浦肯野细胞自发性单纯峰电位放电频率的影响给予300 μmol·L-1的ET完全抑制浦肯野细胞自发性单纯峰电位放电频率，自发性放电频率由给药前的 (100.02±6.46)%降低到 (8.90±3.26)%，冲洗后基本恢复到给药前水平。
2.3 ET对自发性复杂峰电位波形特征和小穗数量的影响300 μmol·L-1的ET完全抑制浦肯野细胞自发性单纯峰电位放电，使自发性复杂峰电位放电小穗数量减少。
3 讨论小脑皮层由分子层、浦肯野细胞层和颗粒细胞层构成，主要包括浦肯野细胞PC、分子层中间神经元 (molecular layer interneuron，MLI)、颗粒细胞 (granule cell，GC) 和高尔基细胞 (Golgi cell)，其中颗粒细胞为兴奋性神经元，以谷氨酸为神经递质, 其余均以GABA作为神经递质的抑制性神经元。
小脑皮层将来自脊髓，脑干和大脑皮层的传入投射，经精密运算与整合后，由PC发出各种输出指令，控制躯体的平衡和眼球的运动，协助大脑皮层控制随意运动，参与随意运动的设计与编程以及运动记忆能力。小脑皮层主要通过苔状纤维和爬行纤维传入外部信息，参与精细运动调节和运动学习。一般认为，经苔状纤维传入的感觉信息通过颗粒细胞的轴突--平行纤维途径来间接地兴奋PC，表现为简单峰电位 (simple spike), 而经爬行纤维传入的感觉信息可兴奋PC, 表现为复杂峰电位 (complex spikes)[3]。
ET降低PC的SS的放电频率并具有浓度依赖性，300 μmol·L-1 ET完全抑制浦肯野细胞的SS放电，故我们在研究ET对浦肯野细胞自发性单纯峰电位放电频率及自发性复杂峰电位波形特征和小穗数量的影响时，选用的ET浓度为300 μmol·L-1。
在哺乳动物小脑皮层，BC的轴突末梢包裹在PC的胞体和轴突起始段，其兴奋可使PC产生迅速而强烈的环胞体抑制，直接影响PC峰电位的输出，而SC的轴突选择性地与PC树突形成抑制性突触联系，SC兴奋可对PC树突产生抑制，分流平行纤维的兴奋性传入，平衡PC树突的兴奋性[4]。因此，我们推测ET明显抑制小脑PC自发性单纯放电频率，可能与ET增强BC和SC自发性活动有关。
我们应用在体电生理学和神经药理学手段研究发现，ET降低在体浦肯野细胞的单纯峰电位放电频率并具有浓度依赖性，ET (300 μmol·l-1) 完全抑制自发性单纯性放电，但自发性复杂峰电位放电依然存在。ET (300 μmol·L-1) 不仅完全抑制自发性单纯性放电，而且抑制自发性复杂峰电位放电小穗数量。在以后的研究中，有必要研究ET对小脑神经元环路、感觉信息传递及突触可塑性的影响，进一步探讨ET麻醉作用的细胞与分子机制。
综上所述，在体条件下脑表面灌流ET明显抑制浦肯野细胞自发放电活动。
| [1] | Herd M B, Lambert J J, Belelli D. The general anaesthetic etomidate inhibits the excitability of mouse thalamocortical relay neurons by modulating multiple modes of GABAA receptor-mediated inhibition[J]. Eur J Neurosci, 2014, 40 (3): 2487-501. doi:10.1111/ejn.12601 |
| [2] | Zhang Y, He J C, Liu X K, et al. Assessment of the effect of etomidate on voltage-gated sodium channels and action potentials in rat primary sensory cortex pyramidal neurons[J]. Eur J Pharmacol, 2014, 736 : 55-62. doi:10.1016/j.ejphar.2014.04.036 |
| [3] | 韩济生. 神经科学[M]. 第3版 北京: 北京大学医学出版社, 2008: 796-818 . Han J S. Neuroscience[M]. The third edition Beijing: Beijing Medical University press, 2008: 796-818 . |
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