参麦注射液是传统中药红参与麦冬的复方制剂，具有益气固脱、养阴生津、生脉等功效。除对心脏和免疫功能疾病的防治外，对缺血性卒中也有明显疗效，其可协同降压药、溶栓药等西药，改善脑缺血预后。两味主药中，红参可保护血管内皮细胞，抗脂质过氧化和清除自由基，麦冬亦可通过保护血管内皮细胞，增强免疫力和耐缺氧能力。然而，由于化学成分的复杂性和功能主治的多样性，其与缺血性卒中关联的作用机制仍不明确，仍停留在整体动物指标，缺乏深入的分子生物学水平，尤其缺乏分子信号通路水平研究，其更能有效地作为生物标记物反映药理效应和作用机制的变化。本研究通过网络药理学[1-2]与实验验证等方法，挖掘参麦注射液中主要成分与缺血性卒中间的关联，阐释其与临床疗效相关的分子机制，有利于加强中药基础与临床研究的沟通，更好地服务于临床。
1 材料与方法 1.1 文本挖掘在TCMGeneDIT系统中，以两味主药红参、麦冬中的20个成分为研究对象(其中鲁司可皂苷元和薯蓣皂苷元以这2个皂苷元的英文名为搜索词)，搜索条件的阈值为大于概率0.95，以自动文本挖掘方式搜索与化合物相互作用的蛋白信息。同样在Agilent Literature Search中，以人参和麦冬英文名进行搜索，对TCMGeneDIT数据库中的蛋白信息进行补充。
1.2 反向对接在Pharmmapper数据库中，以成分的mol2格式输入search栏中，设置参数为不选择构象变化，其余设置参数为默认选项，截断值为2.0，选择人类数据库，产生默认的300个构象后，按照打分最终选取50个蛋白构象。将反向对接产生的构象与“1.1”节中文本挖掘所产生的构象，合并为参麦注射液作用蛋白集。
1.3 参麦注射液多成分-蛋白网络与信号通路的映射在Genecards数据库中，以stroke进行搜索，搜索出与stroke相关联的2 494个蛋白，与“1.2”节中蛋白集进行交集，最终得参麦注射液化合物相互作用蛋白群。以相互作用蛋白群中的蛋白名为检索词，从Genecards、BIND、BioGRID、IntAct、MINT等数据库中，建立蛋白关联词条，Cytoscape中建立蛋白相互作用网络。ClusterONE插件提取具有显著性差异(P < 0.05) 的子网络，并将网络中关键蛋白进行Biocart信号通路映射。
1.4 小鼠局灶性中动脉梗死(MCAO) 模型制备及参麦注射液给药C57BL/6J小鼠，体质量18~22 g，扬州大学比较医学中心提供。参麦注射液(正大青春宝药业有限公司)。术前1 h参麦注射液5 mL·kg-1腹腔注射。
1.5 Western blot法与统计学分析Western blot法检测小鼠皮层边缘组织p38、ERK1、ERK2、IKKα、IKKβ表达(抗体1 :1 000稀释)。实验数据用Graphpad Prism 5.0统计软件进行单因变量多因素方差分析。
2 结果 2.1 参麦注射液主要成分-蛋白网络的分析参麦注射液的20个成分，共作用于61个蛋白，参麦注射液多成分蛋白网络平均Degree为4.165，其中14个成分其连接度达到5以上，人参皂苷与全部蛋白网络中的蛋白均有相互作用。2个麦冬皂苷元成分与CASP3、CHUK、HSAP90AA1、MAPK1、MAPK14、NFKB1 6个蛋白有相互作用，这6个蛋白在网络中占据高连接度，对网络健康度有极大影响。
2.2 蛋白相互作用网络的分析60个蛋白构成无孤立结点的蛋白相互作用网络，提取差异有显著性(P < 0.01) 的子网络1个，子网络中含有关键蛋白19个(Tab 1)，在Biaocart信号通路上映射及富集分析(Tab 2)，涉及MAPK、NF-κB、AKT与Toll样受体等信号通路。
| Subnetwork with significant difference |
Term | Subnetwork with significant difference |
Term |
| 1 | ACE | 11 | NOS3 |
| 2 | AKT1 | 12 | PIK3CA |
| 3 | BCL2 | 13 | RELA |
| 4 | CHUK | 14 | TNF |
| 5 | ESR1 | 15 | TLR4 |
| 6 | HSP90AA1 | 16 | MAPK1 |
| 7 | HSP90B1 | 17 | MAPK3 |
| 8 | IKBKB | 18 | MAPK8 |
| 9 | NFKB1A | 19 | MAPK14 |
| 10 | NFKB1 |
| Signaling pathway term | P value |
| MAPKinase signaling pathway | 3.14×10-8 |
| NF-κB signaling pathway | 2.65×10-7 |
| Toll-like receptor pathway | 1.69×10-6 |
| TNF/stress related signaling | 1.21×10-6 |
| AKT signaling pathway | 7.14×10-5 |
MAPK信号通路是富集指数P最小的信号通路，是参麦注射液作用于MCAO模型最有可能的潜在信号通路，与MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14蛋白所调控的MAPK受体及信号通路变化一致。参麦注射液干预后，对MCAO模型中上调的p38、ERK1、IKKβ的磷酸化表达有明显下调作用(P < 0.01)。
3 讨论本研究中，参麦注射液主要成分蛋白网络平均Degree为4.165，不仅表明中药多成分、多靶点的特点，同时也说明参麦注射液主要成分对网络的健康度影响较大。麦冬皂苷作用于含6个蛋白的子网络，剔除这6个蛋白后，网络度由4.165下降到2.332，平均蛋白连接度下降1.833，表明麦冬皂苷虽然作用的蛋白较少，但是能够作用于网络的关键蛋白结点。
参麦注射液主要成分作用的蛋白包括丝氨酸/苏氨酸激酶AKT、PI3K蛋白、丝裂原激酶蛋白家族、热休克蛋白90、Toll样受体4等，其参与炎症反应、细胞代谢与细胞免疫等作用。而作用的主要信号通路中，p38MAPK信号通路可调节脑中水通道蛋白9的表达，调节局部脑缺血[3]。AKT-GSK3-CREB信号通路参与提高脑缺血后脑源性神经营养因子BDNF表达，保护脑缺血[4]。Toll 4受体所代表的Toll信号通路，可作用于HMGB-1，参与脑缺血/再灌注作用[5]。NF-κB和TNF信号通路所代表的经典炎症通路[6]，参与炎症因子的释放，与缺血性卒中的机制密切相关。参麦注射液干预MCAO模型后，p38、ERK1和IKKβ的表达降低，证实了网络药理学可为实验验证提供先导信息，初步揭示其防治疾病的分子机制，为进一步实验研究奠定科学基础。
( 致谢: 本实验于南昌大学第一附属医院科研平台实验室完成。感谢实验室老师与全体同学的大力帮助！ )
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