2. 浙江大学城市学院医学院药学研究所，浙江 杭州 310015
2. Dept of Pharmacy, School of Medicine, Zhejiang University City College, Hangzhou 310015, China
神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB) 是常见的儿童恶性肿瘤，在手术、放化疗及介入等多种手段综合治疗下，总体疗效仍然极差。近年来研究发现，果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2，EZH2) 能抑制相关抑癌基因，明显增加神经母细胞瘤发生、发展的风险[1]。GSK126是一种新型的选择性EZH2抑制剂[2-3]，其在实体瘤方面的药效探究目前相对较少。本文将对GSK126在神经母细胞瘤Neuro-2a细胞中的作用及其可能机制作初步探讨。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器GSK126(上海瀚香生物科技有限公司)；兔多克隆抗体phosph-mTOR (Ser2448)、phosph-S6(Ser240/244)、mTOR和S6(美国Cell Signaling Technology公司)；流式细胞仪FACSCalibur (美国BD公司)。
1.2 方法GSK126先溶解于DMSO，保存于-20 ℃，实验时用培养基稀释到所需终浓度，低、中、高剂量组分别设定为5、20、50 μmol·L-1。采用SRB法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡，以无血清培养细胞观察GSK126对细胞分化的影响，蛋白印迹法检测mTOR信号通路相关蛋白的表达。
1.3 统计学分析采用SPSS16.0统计软件包处理分析数据。数据用x±s表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA) 检验统计学差异。
| Group | G0/G1 | S | G2/M | Apoptotic rate/% |
| Control | 0.521±0.025 | 0.203±0.019 | 0.276±0.013 | 7.9±1.5 |
| GSK126 5 μmol·L-1 | 0.536±0.023 | 0.189±0.012 | 0.275±0.021 | 8.1±1.2 |
| GSK126 25 μmol·L-1 | 0.502±0.019 | 0.240±0.021 | 0.258±0.017 | 8.6±2.1 |
| GSK126 50 μmol·L-1 | 0.464±0.031 | 0.332±0.032 | 0.204±0.029 | 14.7±1.9 |
| *P < 0.05 vs control group | ||||
GSK126在5~25 μmol·L-1间未显示明显的抑制作用，抑制率在10%以下，当浓度增加到50 μmol·L-1时则显示较强抑制作用，抑制率达到70%以上。
2.2 GSK126对Neuro-2a细胞周期及细胞凋亡的影响不同浓度GSK126(5、20、50 μmol·L-1) 处理细胞后，流式细胞仪检测结果显示，5、20 μmol·L-1的GSK126给药组细胞周期及凋亡比例未发生明显改变。但50 μmol·L-1GSK126诱发明显的细胞凋亡，且细胞处于G0/G1期及G2/M期的比例明显下降，细胞生长主要阻滞在S期，差异有统计学意义(P < 0.05)，见Tab 1。
2.3 GSK126明显促进Neuro-2a细胞的分化10%血清培养对照组细胞一直处于增殖状态。无血清培养基对照组培养12 h后，细胞虽有明显延伸的突起，但突起较细较短，且分化细胞数(突起长度为胞体直径2倍以上的细胞) 仅占(10.2±1.1)%。而GSK126处理的细胞在无血清培养基培养12 h后，细胞突起生长明显，同时胞体直径明显变大，低、中、高GSK126剂量组分化细胞分别占(15.2±1.5)% (P < 0.05)、(20.3±2.1)%(P < 0.05) 和(30.4±3.1)%(P < 0.01)。
2.4 GSK126能有效抑制Neuro-2a细胞mTOR信号通路活性在不同浓度GSK126(5、20、50 μmol·L-1) 作用下，磷酸化mTOR蛋白与总蛋白的比值分别下降到对照组的81%(P < 0.05)、73%(P < 0.05) 和61%(P < 0.01)，磷酸化S6蛋白与总蛋白的比值分别下降到对照组的82%(P < 0.05)、67%(P < 0.05) 和56%(P < 0.01)，随药物浓度呈剂量依赖性下降。
3 讨论本研究发现GSK126在低浓度下抑制Neuro-2a细胞增殖和促进凋亡的作用并不明显，但能有效促进细胞分化，并且随着GSK126药物浓度的增加，分化细胞的比例亦相应增加。研究表明，EZH2对神经细胞特性的维持和细胞分化过程具有调控作用，与多种神经系统肿瘤的发生、分级及治疗密切相关[1, 4]。由此提示GSK126作为EZH2的抑制剂，可能通过影响神经母细胞瘤分化状态，进而改变神经肿瘤的预后。
在众多参与神经母细胞瘤细胞增殖分化的细胞信号传导通路中，mTOR处于枢轴位置。已在神经母细胞瘤患者中证实，mTOR信号病理性激活是病情预后不良的标志[5]，下调EZH2的表达可抑制mTOR信号的异常激活[6]。本研究表明，随着EZH2蛋白特异性抑制剂GSK126药物浓度的增加，mTOR及S6等mTOR信号相关蛋白磷酸化降低，mTOR通路活性下降，且Neuro-2a细胞变大、突起变粗变长、分化细胞的比例相应增加。由此可见，GSK126适度下调mTOR活性有利于其调控Neuro-2a细胞分化。本研究中，高剂量GSK126作用下亦可抑制细胞增殖和促进凋亡，这对于Neuro-2a细胞进行分化和维持分化状态可能也起到了必不可少的作用。在后续的研究中，我们将以此为基础，对GSK126的作用机制，特别是通过调节mTOR信号通路调节神经母细胞瘤分化的具体机制做进一步的探究，以期找到可能的关键靶点，从而为神经母细胞瘤的治疗提供新的方法和策略。
| [1] | Swartling F J, aner M, Frantz A, et al. Deregulated proliferation and differentiation in brain tumors[J]. Cell Tissue Res, 2015, 359 (1): 225-54. doi:10.1007/s00441-014-2046-y |
| [2] | Mccabe M T, Ott H M, Ganji G, et al. EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations[J]. Nature, 2012, 492 (7427): 108-12. doi:10.1038/nature11606 |
| [3] | Chen Y T, Zhu F, Lin W R, et al. The novel EZH2 inhibitor, GSK126, suppresses cell migration and angiogenesis via down regulating VEGF-A[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2016, 77 (4): 757-65. doi:10.1007/s00280-016-2990-1 |
| [4] | 陈小霞, 谢娟, 黄成, 等. EZH2对HSC-T6细胞增殖活化的影响及其部分机制研究[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (8): 1061-5. Chen X X, Xie J, Huang C, et al. EZH2 plays a role in HSC-T6 cell proliferation and activation affecting MAPK/ERK and PI3K/AKT pathway[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (8): 1061-5. |
| [5] | Opel D, Poremba C, Simon T, et al. Activation of Akt predicts poor outcome in neuroblastoma[J]. Cancer Res, 2007, 67 (2): 735-45. doi:10.1158/0008-5472.CAN-06-2201 |
| [6] | Zhang W, Lv S H, Liu J, et al. PCI-24781 down-regulates EZH2 expression and then promotes glioma apoptosis by suppressing the PIK3K/Akt/mTOR pathway[J]. Genet Mol Biol, 2014, 37 (4): 716-24. doi:10.1590/S1415-47572014005000011 |