2. 深圳翰宇药业股份有限公司，深圳 518057
2. Hybio Pharmaceutical Co, LTD, Shenzhen 518057, China
目前关于2型糖尿病(T2DM) 的治疗新靶点有二肽基肽酶-4、钠-葡萄糖协同转运蛋白-2、胰高血糖素样肽1受体(glucagon-like peptide 1 receptor, GLP-1R) 等[1]。其中GLP-1R属于G蛋白偶联受体(GPCRs) 家族中的胰高血糖素受体亚家族，主要在胰岛β细胞表达，被认为是一个治疗T2DM的关键靶受体[2]。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1) 是肠道内L细胞分泌的一种肽类激素，是内源性GLP-1R激动剂，通过与GLP-1R结合，激活腺苷酸环化酶，促进细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosinemonophosphate, cAMP) 水平升高，正性调节胞内Ca2+水平，从而刺激胰岛素的合成。GLP-1具有促进胰岛素释放、增加肝糖原储存量、延缓胃排空、降低食欲、抑制β细胞凋亡、抑制餐后胰高血糖素的分泌、缓解低血糖、减轻体重等优点[3-4]，故GLP-1类降糖药物的应用是2型糖尿病治疗中的一个重要发展。由于GLP-1的T1/2不足5 min，在体内很快被二肽基肽酶-4降解和肾脏清除而失效，限制了其临床应用[5]，开发治疗效果更好、副作用更小的GLP-1类似物以及小分子GLP-1R激动剂成为研究重点，开发过程需要建立可靠、灵敏的细胞筛选模型。
根据GPCRs的信号通路特性, 其筛选模型大致可以分为3类：第1类是基于受、配体结合检测的分析方法；第2类是基于第二信使检测的分析方法；第3类是基于受体功能反应的报告基因检测方法[6]。而cAMP作为主要第二信使，直接检测其含量的变化可直观反映GLP-1及其类似物的活性[7-8]，目前常用检测方法有均相时间分辨荧光法(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF)、放射性免疫分析法、ELISA法等。放射性免疫分析法存在放射性物质，不适合作为大量筛选药物的常规手段。与ELISA法比，HTRF法不需洗涤，易于自动化，能够微量且快速操作，结果稳定，对cAMP具有高特异性。因此，HTRF法以操作简单、灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠、假阳性率低等明显优势被更广泛应用[9]。本实验试图建立稳定表达GLP-1R的细胞株，为筛选GLP-1R激动剂药物奠定模型基础。
1 材料与方法 1.1 材料分子克隆所需的胰蛋白胨、酵母提取物及琼脂糖均购自英国Oxoid公司；PCR酶购自日本东洋纺生物科技有限公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶等工具酶购自美国Thermo Fisher Scientific公司；PCR产物回收试剂、凝胶回收试剂和质粒小提试剂均购自中国美基生物有限公司；cAMP检测试剂购自法国Cisbio公司；细胞培养所用DMEM培养基和类胎牛血清购自美国Gibco公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；G418购自美国Tocris Bioscience公司；商业化制剂利拉鲁肽(Liraglutide) 购自丹麦Novo Nordisk公司；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX) 购自美国MP Biomedicals公司；GFP抗体(sc-9996) 购自Santa Cruz公司；GAPDH抗体(AB-P-R 001) 购自GOOD HERE公司；大肠杆菌DH5α、真核表达载体pEGFP-N3和HEK293A细胞株由本实验室保存；质粒pENTER-GLP-1R购自山东维真公司；其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。
1.2 表达质粒的构建[10]以含有人源GLP-1R基因的质粒pENTER-GLP-1R为模板，PCR扩增GLP-1R基因，上、下游引物分别引入XhoI和EcoRI酶切位点及保护碱基，编码基因不含终止密码子。上游引物：5′-CCGCTCGAGCTATGGCCGGCGCCC-3′(XhoI)，下游引物：5′-CCGGAATTCGAACTGCAGGAGGCCTGGCAA-3′(EcoRI)。PCR产物插入pEGFP-N3表达质粒，具体操作如下：PCR产物和pEGFP-N3质粒分别用限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4 DNA连接酶过夜连接后转化DH5α感受态细胞，卡那霉素(50 mg·L-1) 筛选培养，经菌落PCR鉴定，挑取阳性克隆扩增后，提取质粒进行双酶切和DNA测序鉴定。最终获得重组质粒命名为pEGFP-GLP-1R。
1.3 细胞转染及荧光观察HEK293A细胞接种6孔板中，于含10%(V/V) 类胎牛血清的DMEM培养基，37℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞融合至60%为最佳转染状态。按照Lipofectamine 2000试剂操作说明分别进行空白质粒pEGFP-N3和重组质粒pEGFP-GLP-1R的转染，转染5 h后，更换为含5%(V/V) 类胎牛血清的DMEM培养基，继续培养细胞至24 h，荧光显微镜下观察绿色荧光信号在细胞的表达与分布。
1.4 筛选稳定表达GLP-1R-GFP的293A细胞[11]Lipofectamine 2000介导pEGFP-GLP-1R质粒转染细胞，转染24 h后，以1 :10稀释细胞接种于含G418(1 g·L-1) 的DMEM培养液中，在10 cm培养皿继续培养，筛选至d 14，荧光显微镜下可观察到带GFP荧光细胞集落，板底画圈标记，操作台内仔细刮掉圈外非荧光细胞团，加0.25%胰酶消化细胞克隆集落转至小皿，获得稳定表达GLP-1R-GFP的细胞，用含低浓度G418(500 mg·L-1) DMEM培养液维持培养细胞1周后，更换为正常培养基培养。
1.5 Western blot检测GLP-1R-GFP蛋白表达水平野生型HEK293A细胞为空白对照组，瞬时转染pEGFP-N3空质粒的HEK293A细胞为阳性对照组，稳转GLP-1R-GFP-293A的细胞为实验组，收集细胞，加入预冷PBS洗涤2遍，加入细胞裂解液后置于冰上30 min，13 000 r·min-1，4℃离心15 min，取上清。取25 μg处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，并电转移至PVDF膜上，含5%脱脂奶的TBST室温封闭1 h，分别与GFP一抗(1 :1 000)、GAPDH一抗(1 :1 000) 于4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，与标记有HRP的二抗(1 :5 000) 室温孵育2 h，TBST洗膜后显影曝光，对目的蛋白的分子量及表达量进行分析，GAPDH表达作为内参。
1.6 GLP-1R-GFP-293A细胞株的活性分析及cAMP检测试剂使用条件的优化利用Cisbio公司生产的cAMP检测试剂，给予已上市药制剂利拉鲁肽刺激细胞产生cAMP，通过HTRF法检测cAMP含量的变化，检测上述获得的GLP-1R-GFP-293A稳转细胞株活性。具体操作如下：胰酶消化细胞，离心1 000 r·min-1，5 min，收集细胞沉淀，用缓冲液(含0.5 mmol·L-1 IBMX和0.1% BSA的PBS) 重悬细胞，用快速移液器(Multidrop Combi) 将5μL含有细胞的分析缓冲液加入到384孔标准白板中，再加入5 μL的利拉鲁肽，浓度范围为0.33×10-6~6.4×10-3 μmol·L-1，用透明封板膜密封，放入37℃、5% CO2培养箱中，孵育30 min。用Multidrop Combi先后将5 μL cAMP-d2工作液和Anti-cAMP antibody-cryptate工作液加入到反应板相应孔中，室温避光孵育1 h。利用多功能酶标仪检测665 nm与615 nm的吸光值，并用两者的比值代表cAMP含量，或利用标准曲线(Fig 3A) 将比值换算成cAMP浓度[12]。参照cAMP检测试剂说明书建议，以2 000个细胞为检测体系，在100 nmol·L-1的利拉鲁肽刺激下，比较稳转GLP-1R-GFP-293A细胞与野生型HEK293A细胞的665 nm/615 nm的吸光值比值，分析GLP-1R-GFP-293A细胞的活性。100 nmol·L-1的利拉鲁肽刺激GLP-1R-GFP-293A细胞的不同检测数目：400、800、1 600、3 000个细胞，比较665 nm/615 nm的吸光值比值，确定最佳检测体系的细胞个数。
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| Fig 3 Assay optimization and validation of GLP-1R-GFP-293A cell model A: The standard curve of cAMP, the effective range of cAMP is between A and B respectively; B: Activity comparison of the GLP-1R-GFP-293A stable cell line using 2 000 cells; C: Optimization of cell number for cAMP measurement treated with 100 nmol·L-1 of Liraglutide; D: Detection of the EC50 of Liraglutide using prepared cell model with optimum cell number.*P < 0.05, **P < 0.01 vs control |
利用梯度浓度稀释的利拉鲁肽刺激GLP-1R-GFP-293A细胞，在最佳细胞检测数目时，检测利拉鲁肽的EC50值，进一步验证GLP-1R-GFP-293A细胞筛选模型的可行性。
1.7 统计学分析所有实验数据均已重复3次独立的平行实验，并用Origin 9.0统计软件进行分析，结果以x±s表示。对照组与实验组的比较，采用独立样本t检验。
2 结果 2.1 pEGFP-GLP-1R质粒构建与鉴定目的基因片段经PCR获得，连接入载体后经菌落PCR鉴定，获得大小约1.3 kb条带(Fig 1A、1B)。挑取阳性克隆并提取质粒进行XhoI和EcoRI双酶切鉴定，获得大小约6 kb、4.7 kb、1.3 kb的条带(Fig 1C)，所获目的条带的大小正确。质粒经双向测序鉴定，碱基序列与插入方向完全正确，最终获得重组质粒命名为pEGFP-GLP-1R。
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| Fig 1 Construction and identification of plasmids pEGFP-GLP-1R A: The fragments of GLP-1R were amplified by PCR from the template of pENTER-GLP-1R; B: The positive plasmids with GLP-1R were identified using colony-PCR; C: The target plasmids were digested with XhoI and EcoRI.M: Marker; X: XhoI; E: EcoRI |
Lipofectamine 2000介导pEGFP-GLP-1R质粒转染HEK293A细胞24 h后，荧光显微镜下观察瞬时转染后绿色荧光信号分布。pEGFP-N3空质粒组，绿色荧光均匀分布在细胞质内，而pEGFP-GLP-1R重组质粒组，绿色荧光主要分布在细胞膜上，符合GLP-1R膜受体分布[13]。结果表明，构建的重组质粒可有效表达pEGFP-GLP-1R融合蛋白(Fig 2A)。
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| Fig 2 Detection of distribution and expression of GLP-1R-GFP in HEK293A cells by fluorescence microscopy and Western blot A:Detection of the distribution of GFP by fluorescence microscopy; B:Detection of the expression level of GLP-1R-GFP protein by Western blot.1:HEK293A transfected with lipofectamine 2000 only; 2:HEK293A transfected with pEGFP-N3 vector; 3:HEK293A transfected with pEGFP-GLP-1R plasmid |
转染24 h后，在含有G418(1 g·L-1) 的选择培养基中筛选4周，获得稳定表达GLP-1R的细胞，命名为GLP-1R-GFP-293A细胞株，细胞融合至80%时GFP荧光阳性率高达100%。进一步Western blot验证，结果表明GLP-1R-GFP融合蛋白在稳转GLP-1R-GFP-293A细胞株高表达，且分子量大小正确，约82 ku (Fig 2B)。
2.4 GLP-1R-GFP-293A细胞株的活性功能鉴定如Fig 3B所示，检测体系初始为2 000个细胞，100 nmol·L-1的利拉鲁肽刺激后，与质粒对照组比，稳转GLP-1R-GFP-293A细胞株的cAMP含量明显升高(cAMP含量与665 nm/615 nm的吸光值比值呈反比，Delta F%表示665 nm/615 nm的吸光值比值，P < 0.05)，而野生型HEK293A细胞的组间差异则无统计学意义(P> 0.05)。结果显示，检测体系为800个细胞时，空白对照组与利拉鲁肽实验组的cAMP含量差异具有显著性意义(P < 0.01)，且符合标准曲线的有效范围，故该细胞模型的最佳检测体系为800个细胞(Fig 3C)，同时优化了cAMP检测试剂的检测条件。
为了进一步验证GLP-1R-GFP-293A细胞筛选模型的可行性，给予梯度浓度稀释的利拉鲁肽刺激GLP-1R-GFP-293A细胞的最佳检测体系，检测结果表明利拉鲁肽的EC50值为5.24 nmol·L-1(Fig 3D)，与文献已报道范围一致[14]，结果表明该细胞模型可用于GLP-1R激动剂体外活性评价。
3 讨论GLP-1及其类似物具有葡萄糖浓度依赖性地降低血糖的作用及对胰岛β细胞的促生长作用，是治疗糖尿病最有潜力的药物之一。本研究成功构建了真核表达载体pEGP-GLP-1R，转染至HEK293A细胞，经G418筛选获得了高效表达GLP-1R的稳转细胞株，为GLP-1类似物的活性检测提供了稳定细胞筛选模型。
本文所采用的HTRF技术结合了荧光共振能量转移和时间分辨荧光两种技术，是基于铕穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物) 之间的荧光共振能量转移，其特点有：荧光持续时间更久、读取测量时间延迟、低背景、降低干扰因素、均质式检测、抵御金属离子对信号的影响[15]。本工作利用HTRF法检测细胞内cAMP含量变化，对细胞进行了活性分析，在100 nmol·L-1的利拉鲁肽刺激下，稳转GLP-1R-GFP-293A细胞株的cAMP含量明显升高，而野生型HEK293A细胞则无变化，表明构建的GLP-1R-GFP稳转细胞株具有响应GLP-1类似物的功能。在非药物刺激条件下细胞自然产生cAMP的含量应极低，给予GLP-1受体激动剂刺激后则明显升高cAMP的产生量，据此评价GLP-1类似物的活性高低，故本细胞模型对GLP-1类似物进行活性检测的关键在于细胞数，而最佳反应时间和温度均依据检测试剂的应用条件而定，分别为30 min、37 ℃。通过探索不同检测体系对100 nmol·L-1的利拉鲁肽的响应值，最后确定了cAMP检测试剂的最佳细胞数量为800个，在此最佳检测条件下，梯度稀释的GLP-1类似物利拉鲁肽刺激细胞产生cAMP的EC50值为5.24 nmol·L-1，与相关文献报道范围一致。表明本细胞模型灵敏、可靠、稳定，利用该模型优化现有的cAMP检测试剂的使用条件，为筛选GLP-1类似物以及GLP-1R小分子激动剂奠定了模型基础。
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