2. 深圳翰宇药业股份有限公司,深圳 518057
2. Hybio Pharmaceutical Co, LTD, Shenzhen 518057, China
目前关于2型糖尿病(T2DM) 的治疗新靶点有二肽基肽酶-4、钠-葡萄糖协同转运蛋白-2、胰高血糖素样肽1受体(glucagon-like peptide 1 receptor, GLP-1R) 等[1]。其中GLP-1R属于G蛋白偶联受体(GPCRs) 家族中的胰高血糖素受体亚家族,主要在胰岛β细胞表达,被认为是一个治疗T2DM的关键靶受体[2]。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1) 是肠道内L细胞分泌的一种肽类激素,是内源性GLP-1R激动剂,通过与GLP-1R结合,激活腺苷酸环化酶,促进细胞内环磷酸腺苷(cyclic adenosinemonophosphate, cAMP) 水平升高,正性调节胞内Ca2+水平,从而刺激胰岛素的合成。GLP-1具有促进胰岛素释放、增加肝糖原储存量、延缓胃排空、降低食欲、抑制β细胞凋亡、抑制餐后胰高血糖素的分泌、缓解低血糖、减轻体重等优点[3-4],故GLP-1类降糖药物的应用是2型糖尿病治疗中的一个重要发展。由于GLP-1的T1/2不足5 min,在体内很快被二肽基肽酶-4降解和肾脏清除而失效,限制了其临床应用[5],开发治疗效果更好、副作用更小的GLP-1类似物以及小分子GLP-1R激动剂成为研究重点,开发过程需要建立可靠、灵敏的细胞筛选模型。
根据GPCRs的信号通路特性, 其筛选模型大致可以分为3类:第1类是基于受、配体结合检测的分析方法;第2类是基于第二信使检测的分析方法;第3类是基于受体功能反应的报告基因检测方法[6]。而cAMP作为主要第二信使,直接检测其含量的变化可直观反映GLP-1及其类似物的活性[7-8],目前常用检测方法有均相时间分辨荧光法(homogeneous time-resolved fluorescence, HTRF)、放射性免疫分析法、ELISA法等。放射性免疫分析法存在放射性物质,不适合作为大量筛选药物的常规手段。与ELISA法比,HTRF法不需洗涤,易于自动化,能够微量且快速操作,结果稳定,对cAMP具有高特异性。因此,HTRF法以操作简单、灵敏度高、通量大、实验数据稳定可靠、假阳性率低等明显优势被更广泛应用[9]。本实验试图建立稳定表达GLP-1R的细胞株,为筛选GLP-1R激动剂药物奠定模型基础。
1 材料与方法 1.1 材料分子克隆所需的胰蛋白胨、酵母提取物及琼脂糖均购自英国Oxoid公司;PCR酶购自日本东洋纺生物科技有限公司;T4 DNA连接酶、限制性内切酶等工具酶购自美国Thermo Fisher Scientific公司;PCR产物回收试剂、凝胶回收试剂和质粒小提试剂均购自中国美基生物有限公司;cAMP检测试剂购自法国Cisbio公司;细胞培养所用DMEM培养基和类胎牛血清购自美国Gibco公司;转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;G418购自美国Tocris Bioscience公司;商业化制剂利拉鲁肽(Liraglutide) 购自丹麦Novo Nordisk公司;3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX) 购自美国MP Biomedicals公司;GFP抗体(sc-9996) 购自Santa Cruz公司;GAPDH抗体(AB-P-R 001) 购自GOOD HERE公司;大肠杆菌DH5α、真核表达载体pEGFP-N3和HEK293A细胞株由本实验室保存;质粒pENTER-GLP-1R购自山东维真公司;其他试剂均为国产或进口分析纯试剂。
1.2 表达质粒的构建[10]以含有人源GLP-1R基因的质粒pENTER-GLP-1R为模板,PCR扩增GLP-1R基因,上、下游引物分别引入XhoI和EcoRI酶切位点及保护碱基,编码基因不含终止密码子。上游引物:5′-CCGCTCGAGCTATGGCCGGCGCCC-3′(XhoI),下游引物:5′-CCGGAATTCGAACTGCAGGAGGCCTGGCAA-3′(EcoRI)。PCR产物插入pEGFP-N3表达质粒,具体操作如下:PCR产物和pEGFP-N3质粒分别用限制性内切酶XhoI和EcoRI双酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化,经T4 DNA连接酶过夜连接后转化DH5α感受态细胞,卡那霉素(50 mg·L-1) 筛选培养,经菌落PCR鉴定,挑取阳性克隆扩增后,提取质粒进行双酶切和DNA测序鉴定。最终获得重组质粒命名为pEGFP-GLP-1R。
1.3 细胞转染及荧光观察HEK293A细胞接种6孔板中,于含10%(V/V) 类胎牛血清的DMEM培养基,37℃、5% CO2的培养箱中培养。待细胞融合至60%为最佳转染状态。按照Lipofectamine 2000试剂操作说明分别进行空白质粒pEGFP-N3和重组质粒pEGFP-GLP-1R的转染,转染5 h后,更换为含5%(V/V) 类胎牛血清的DMEM培养基,继续培养细胞至24 h,荧光显微镜下观察绿色荧光信号在细胞的表达与分布。
1.4 筛选稳定表达GLP-1R-GFP的293A细胞[11]Lipofectamine 2000介导pEGFP-GLP-1R质粒转染细胞,转染24 h后,以1 :10稀释细胞接种于含G418(1 g·L-1) 的DMEM培养液中,在10 cm培养皿继续培养,筛选至d 14,荧光显微镜下可观察到带GFP荧光细胞集落,板底画圈标记,操作台内仔细刮掉圈外非荧光细胞团,加0.25%胰酶消化细胞克隆集落转至小皿,获得稳定表达GLP-1R-GFP的细胞,用含低浓度G418(500 mg·L-1) DMEM培养液维持培养细胞1周后,更换为正常培养基培养。
1.5 Western blot检测GLP-1R-GFP蛋白表达水平野生型HEK293A细胞为空白对照组,瞬时转染pEGFP-N3空质粒的HEK293A细胞为阳性对照组,稳转GLP-1R-GFP-293A的细胞为实验组,收集细胞,加入预冷PBS洗涤2遍,加入细胞裂解液后置于冰上30 min,13 000 r·min-1,4℃离心15 min,取上清。取25 μg处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,并电转移至PVDF膜上,含5%脱脂奶的TBST室温封闭1 h,分别与GFP一抗(1 :1 000)、GAPDH一抗(1 :1 000) 于4 ℃孵育过夜,TBST洗膜后,与标记有HRP的二抗(1 :5 000) 室温孵育2 h,TBST洗膜后显影曝光,对目的蛋白的分子量及表达量进行分析,GAPDH表达作为内参。
1.6 GLP-1R-GFP-293A细胞株的活性分析及cAMP检测试剂使用条件的优化利用Cisbio公司生产的cAMP检测试剂,给予已上市药制剂利拉鲁肽刺激细胞产生cAMP,通过HTRF法检测cAMP含量的变化,检测上述获得的GLP-1R-GFP-293A稳转细胞株活性。具体操作如下:胰酶消化细胞,离心1 000 r·min-1,5 min,收集细胞沉淀,用缓冲液(含0.5 mmol·L-1 IBMX和0.1% BSA的PBS) 重悬细胞,用快速移液器(Multidrop Combi) 将5μL含有细胞的分析缓冲液加入到384孔标准白板中,再加入5 μL的利拉鲁肽,浓度范围为0.33×10-6~6.4×10-3 μmol·L-1,用透明封板膜密封,放入37℃、5% CO2培养箱中,孵育30 min。用Multidrop Combi先后将5 μL cAMP-d2工作液和Anti-cAMP antibody-cryptate工作液加入到反应板相应孔中,室温避光孵育1 h。利用多功能酶标仪检测665 nm与615 nm的吸光值,并用两者的比值代表cAMP含量,或利用标准曲线(Fig 3A) 将比值换算成cAMP浓度[12]。参照cAMP检测试剂说明书建议,以2 000个细胞为检测体系,在100 nmol·L-1的利拉鲁肽刺激下,比较稳转GLP-1R-GFP-293A细胞与野生型HEK293A细胞的665 nm/615 nm的吸光值比值,分析GLP-1R-GFP-293A细胞的活性。100 nmol·L-1的利拉鲁肽刺激GLP-1R-GFP-293A细胞的不同检测数目:400、800、1 600、3 000个细胞,比较665 nm/615 nm的吸光值比值,确定最佳检测体系的细胞个数。
利用梯度浓度稀释的利拉鲁肽刺激GLP-1R-GFP-293A细胞,在最佳细胞检测数目时,检测利拉鲁肽的EC50值,进一步验证GLP-1R-GFP-293A细胞筛选模型的可行性。
1.7 统计学分析所有实验数据均已重复3次独立的平行实验,并用Origin 9.0统计软件进行分析,结果以x±s表示。对照组与实验组的比较,采用独立样本t检验。
2 结果 2.1 pEGFP-GLP-1R质粒构建与鉴定目的基因片段经PCR获得,连接入载体后经菌落PCR鉴定,获得大小约1.3 kb条带(Fig 1A、1B)。挑取阳性克隆并提取质粒进行XhoI和EcoRI双酶切鉴定,获得大小约6 kb、4.7 kb、1.3 kb的条带(Fig 1C),所获目的条带的大小正确。质粒经双向测序鉴定,碱基序列与插入方向完全正确,最终获得重组质粒命名为pEGFP-GLP-1R。
2.2 细胞转染及荧光观察Lipofectamine 2000介导pEGFP-GLP-1R质粒转染HEK293A细胞24 h后,荧光显微镜下观察瞬时转染后绿色荧光信号分布。pEGFP-N3空质粒组,绿色荧光均匀分布在细胞质内,而pEGFP-GLP-1R重组质粒组,绿色荧光主要分布在细胞膜上,符合GLP-1R膜受体分布[13]。结果表明,构建的重组质粒可有效表达pEGFP-GLP-1R融合蛋白(Fig 2A)。
2.3 稳定表达GLP-1R-GFP细胞株的建立与鉴定转染24 h后,在含有G418(1 g·L-1) 的选择培养基中筛选4周,获得稳定表达GLP-1R的细胞,命名为GLP-1R-GFP-293A细胞株,细胞融合至80%时GFP荧光阳性率高达100%。进一步Western blot验证,结果表明GLP-1R-GFP融合蛋白在稳转GLP-1R-GFP-293A细胞株高表达,且分子量大小正确,约82 ku (Fig 2B)。
2.4 GLP-1R-GFP-293A细胞株的活性功能鉴定如Fig 3B所示,检测体系初始为2 000个细胞,100 nmol·L-1的利拉鲁肽刺激后,与质粒对照组比,稳转GLP-1R-GFP-293A细胞株的cAMP含量明显升高(cAMP含量与665 nm/615 nm的吸光值比值呈反比,Delta F%表示665 nm/615 nm的吸光值比值,P < 0.05),而野生型HEK293A细胞的组间差异则无统计学意义(P> 0.05)。结果显示,检测体系为800个细胞时,空白对照组与利拉鲁肽实验组的cAMP含量差异具有显著性意义(P < 0.01),且符合标准曲线的有效范围,故该细胞模型的最佳检测体系为800个细胞(Fig 3C),同时优化了cAMP检测试剂的检测条件。
为了进一步验证GLP-1R-GFP-293A细胞筛选模型的可行性,给予梯度浓度稀释的利拉鲁肽刺激GLP-1R-GFP-293A细胞的最佳检测体系,检测结果表明利拉鲁肽的EC50值为5.24 nmol·L-1(Fig 3D),与文献已报道范围一致[14],结果表明该细胞模型可用于GLP-1R激动剂体外活性评价。
3 讨论GLP-1及其类似物具有葡萄糖浓度依赖性地降低血糖的作用及对胰岛β细胞的促生长作用,是治疗糖尿病最有潜力的药物之一。本研究成功构建了真核表达载体pEGP-GLP-1R,转染至HEK293A细胞,经G418筛选获得了高效表达GLP-1R的稳转细胞株,为GLP-1类似物的活性检测提供了稳定细胞筛选模型。
本文所采用的HTRF技术结合了荧光共振能量转移和时间分辨荧光两种技术,是基于铕穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物) 之间的荧光共振能量转移,其特点有:荧光持续时间更久、读取测量时间延迟、低背景、降低干扰因素、均质式检测、抵御金属离子对信号的影响[15]。本工作利用HTRF法检测细胞内cAMP含量变化,对细胞进行了活性分析,在100 nmol·L-1的利拉鲁肽刺激下,稳转GLP-1R-GFP-293A细胞株的cAMP含量明显升高,而野生型HEK293A细胞则无变化,表明构建的GLP-1R-GFP稳转细胞株具有响应GLP-1类似物的功能。在非药物刺激条件下细胞自然产生cAMP的含量应极低,给予GLP-1受体激动剂刺激后则明显升高cAMP的产生量,据此评价GLP-1类似物的活性高低,故本细胞模型对GLP-1类似物进行活性检测的关键在于细胞数,而最佳反应时间和温度均依据检测试剂的应用条件而定,分别为30 min、37 ℃。通过探索不同检测体系对100 nmol·L-1的利拉鲁肽的响应值,最后确定了cAMP检测试剂的最佳细胞数量为800个,在此最佳检测条件下,梯度稀释的GLP-1类似物利拉鲁肽刺激细胞产生cAMP的EC50值为5.24 nmol·L-1,与相关文献报道范围一致。表明本细胞模型灵敏、可靠、稳定,利用该模型优化现有的cAMP检测试剂的使用条件,为筛选GLP-1类似物以及GLP-1R小分子激动剂奠定了模型基础。
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