2. 安徽医科大学基础医学院，安徽 合肥 230032
2. School of Basic Medical Sciences, Anhui Medical University, Hefei 230032, China
疼痛作为人类生活中最为常见的身心体验，在2000年被世界卫生组织定义为一类疾病。正常情况下，疼痛可以作为一种保护性机制使机体免于伤害，但在病理状态下又可对人体造成无法估量的损害。疼痛的发病率较高，尤其是病理性疼痛，仍是当今困扰人类健康的一大难题。
5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT) 作为一种自体活性物质，在肠嗜铬细胞中的百分比约为0.90，在血小板中的百分比约为0.08~0.10，在外周作为炎症调节因子与IL-6、TNF-α、缓激肽、前列腺素E2、组胺、去甲肾上腺素等共同发挥作用[1]。作为一种单胺类神经递质，5-HT以约0.01~0.02的百分比存在于中枢神经系统，尤其是中脑缝际核群，参与了体温、睡眠、昼夜节律、运动、情绪等一系列病理生理活动[2]。
5-HT必须通过相应受体的介导才能产生作用[3]。根据对特异性激动剂和拮抗剂选择性的不同，可将5-HT受体(receptor，R) 分为7类，目前认为与疼痛关系密切的受体主要有5-HT1R、5-HT2R、5-HT3R、5-HT4R、5-HT7R，其中5-HT2R又包括5-HT2AR、5-HT2BR、5-HT2CR 3种亚型。以往研究发现，5-HT2AR广泛参与了精神类疾病的发生发展，包括焦虑、抑郁、精神分裂症、药物成瘾等，也在记忆、认知方面发挥了重要的作用[4]。在疼痛模型如完全弗氏佐剂模型、角叉菜胶模型、坐骨神经慢性结扎模型中，5-HT2AR均参与了疼痛调控[3]，但其在各类疼痛模型中致痛或抑痛的复杂作用至今尚未明了，有待进一步探究。
本实验针对急性乙酸内脏痛、急性切口痛和坐骨神经慢性缩窄性损伤(chronic constrictive injury，CCI) 慢性神经病理性痛，通过腹腔注射给药，探索5-HT2AR在外周被特异性抑制剂MDL11939阻断时的疼痛行为学变化，为深入研究5-HT2AR在疼痛中的作用提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物昆明种♂小鼠72只，体质量(28~32) g，由山东济宁市任城区鲁康动物饲料经销中心提供[许可证号：SCXK (鲁)20140007]。小鼠置于昼夜(12 h/12 h) 节律光照条件下，自由进食饮水，室温(23±1)℃，所有小鼠实验前静养1周。
1.2 实验分组内脏痛模型鼠随机分为5组，每组7只。Vehicle组：0.9% NS+1% DMSO；MDL11939+Vehicle组：MDL11939(1.0 mg·kg-1)+0.9% NS；乙酸模型组：1% DMSO+0.6%乙酸(10 mL·kg-1)；MDL11939低、中、高剂量组：MDL11939(0.25、0.5、1.0 mg·kg-1)+0.6%乙酸(10 mL·kg-1)。切口痛模型鼠随机分为2组，每组10只。切口痛组：小鼠进行右足底切口痛手术；MDL11939给药组：小鼠手术后指定时间内测得基础痛阈，然后给予MDL11939(0.5 mg·kg-1)，15 min后记录1 h的热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL) 评分。CCI模型鼠随机分为2组，每组8只。均进行CCI手术处理，术后d 3筛选造模成功的小鼠，于d 7上午8 :00开始进行痛阈检测。CCI组：检测小鼠基础痛阈及其后1 h内的TWL评分；MDL11939给药组：小鼠首先测得基础痛阈，然后给予MDL11939(0.5 mg·kg-1)，15 min后记录1 h内的TWL评分。以上各组动物平均体质量无统计学差异，给药方式均为腹腔给药，给药体积均为0.1 mL·kg-1。
1.3 仪器与药品热辐射刺激仪购自美国IITC公司(IITCseries8)；MDL11939购自Tocris公司(Cat. No.0870)；DMSO购自Biosharp公司。
1.4 动物模型 1.4.1 小鼠急性乙酸内脏痛模型制备小鼠腹腔注射0.6%乙酸，10 mL·kg-1，建立急性内脏痛模型[5]。造模成功的表现为小鼠出现腹部内凹、躯干与后肢伸张、臀部高起等动作。
1.4.2 小鼠急性切口痛模型制备参照Brennan等[6]的方法，小鼠七氟醚吸入麻醉后，碘伏消毒右后爪跖部，用手术刀片从足底近端向足趾方向纵行切开5 mm的条形切口，切开足底皮肤后，用眼科镊提起足底肌肉并进行纵向钝性分离，并保持其起止附着点完整。切口处纱布压迫止血，使用5-0丝线非吸收缝线行褥式缝合。
1.4.3 小鼠CCI模型制备参照Bennett等[7]的方法建立坐骨神经慢性缩窄性损伤模型。小鼠称重，经腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，取侧卧位，备皮，用碘伏消毒皮肤，切开右下肢股部皮肤后，顺肌纹钝性分离股二头肌和臀肌，暴露右侧坐骨神经中上段，于坐骨神经分成3支前的主干部位处，游离神经7 mm左右。用4-0医用铬制肠线间隔1 mm松结扎3处，为了预防强度过大，结扎线的松紧以引起右后肢出现轻微的颤动为宜，从而保护神经外膜的血运。结扎完毕后逐层缝合肌肉层和皮肤。
1.5 小鼠疼痛行为学测定 1.5.1 扭体反应测定MDL11939给药15 min后给予乙酸，观察乙酸腹腔注射后1 h内小鼠扭体反应次数。扭体反应标准[5]为小鼠出现腹部收缩伴随着身体拉长、后肢伸张等非自主性动作。
1.5.2 热缩足反射潜伏期测定急性切口痛于术后4 h进行TWL测定。CCI模型于术后d 3通过TWL筛选造模成功的小鼠，在术后d 7再进行TWL测定。统一采用热辐射刺激仪测定小鼠足底TWL。将有机玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，按Hargreaves等[8]方法用热辐射刺激仪照射小鼠足底，照射开始至小鼠出现抬腿回避时间为TWL。热刺激强度在整个实验过程中维持一致，自动切断时间为25 s，以免造成热辐射损伤，为避免或减少前1次刺激对随后刺激效应造成的影响，同一部位刺激的间隔时间至少为5 min，每只动物测定3次，取平均值作为小鼠TWL值。在具体时间点时只需测定1次。
1.6 统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以x±s表示。各组之间的比较采用双因素重复测量方差分析(two-way repeated measures ANOVA)，组间两两比较采用SNK (Student-Neuman-Keuls) 法检验。
2 结果 2.1 MDL11939对急性乙酸内脏痛小鼠扭体反应的影响与Vehicle组相比，小鼠给予乙酸后，出现腹部收缩伴随着身体拉长、后肢伸张等行为，表现为扭体反应明显增加(Fig 1A、1C，P < 0.01)。与乙酸模型组相比，给予5-HT2A受体拮抗剂MDL11939之后，0.25、0.5、1.0 mg·kg-1给药组扭体反应的次数降低(Fig 1A、1C，P < 0.01)，且在剂量上存在相关性，呈负相关(Fig 1B，r=-0.85)。而MDL11939+Vehicle组，小鼠没有发生扭体反应(Fig 1A)，说明MDL11939对腹腔注射Vehicle组没有引起任何作用，MDL11939在腹腔注射乙酸后的效应是通过5-HT2A受体介导的。以上结果表明，MDL11939可以剂量依赖性地降低急性乙酸内脏痛小鼠的扭体反应次数，明显缓解疼痛。
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| Fig 1 Dose response curves of 5-HT2A antagonist MDL11939 on body writhing reaction of visceral pain induced by intraperitoneal administration of acetic acid in mice A:The number of 1 h cumulative writhing reaction times; B:The dose correlation curve of MDL11939; C:The effect of different doses of MDL11939 on acetic acid pain in 1 h.**P < 0.01 vs control group; ##P < 0.01 vs acetic acid group |
鉴于乙酸内脏痛模型MDL11939腹腔给药呈剂量依赖性地抑制疼痛，在高剂量1.0 mg·kg-1时，小鼠活动被明显抑制，0.5 mg·kg-1就可以有效减轻疼痛，故在其他模型中选取中剂量0.5 mg·kg-1进行实验。在切口痛组和自身切口痛造模4 h后，TWL值降低，痛阈下降。与切口痛组和自身给药前相比，MDL11939在给药后1 h内明显提高了小鼠的热缩足阈值(Fig 2，P < 0.05，P < 0.01)。以上结果表明MDL11939可以有效地减轻急性切口痛。
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| Fig 2 Effects of 5-HT2A antagonist MDL11939on ipsilateral TWL of acute incision pain in mice The time-course of TWL in incision pain mice.#P < 0.05, ##P < 0.01 vs incision pain group |
术后d 3筛选出造模成功的小鼠，于d 7进行TWL测定时发现，CCI模型组小鼠的TWL评分相对健侧明显降低，表明痛阈下降。在MDL11939给药后1 h内，小鼠的热缩足阈值明显提高(Fig 3，P < 0.05，P < 0.01)，以上结果表明MDL11939可以有效地缓解CCI神经病理性痛。
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| Fig 3 Effects of MDL11939 on ipsilateral TWLof CCI chronic neuropathic pain in mice The time-course of TWL after intraperitoneal administration of 5-HT2A antagonist MDL 11939 in CCI mice in 1 h.#P < 0.05, ##P < 0.01 vs CCI group |
5-HT2AR在外周存在于黏膜下神经丛、背根神经节、表皮真皮结合处的无髓鞘轴突等部位，高表达于初级感觉神经元，在中枢表达于脊髓、大脑皮质、杏仁核、海马、室旁核等众多脑区，参与了外周伤害性感受的外周敏化和中枢敏化过程[9]。
疼痛作为一种常见的伤害性感受，5-HT2AR在疼痛领域中的作用也受到越来越多的关注。本实验通过建立急性乙酸内脏痛、急性切口痛和CCI神经病理性痛模型，经腹腔系统性给药，发现MDL11939可以有效地减轻乙酸内脏痛小鼠扭体反应次数，提高切口痛和CCI痛小鼠患侧的TWL阈值。以往研究发现，在坐骨神经CCI模型中，5-HT在损伤侧神经表达增多，在脊髓表达降低[10]；鞘内注射5-HT2A/2C受体激动剂α甲基5-HT可以剂量依赖性地抑制热敏痛，这种作用可被预先鞘内注射5-HT2AR的拮抗剂Ketanserin逆转[11]；在脊神经结扎(SNL) 模型中，5-HT2AR介导了神经损伤引起的痛觉超敏和神经病理性痛[12]。以上结果表明，在神经损伤病理性痛模型中，5-HT及5-HT2AR在外周和脊髓的表达可能存在差异。脊髓5-HT2AR能够降低慢性内脏痛大鼠的痛觉敏化[13]，而本实验中5-HT2AR介导了急性乙酸内脏痛小鼠扭体反应的增加。切口痛模型中，5-HT2AR提高了切口痛患侧的疼痛下行易化作用，鞘内注射Ketanserin可以减轻疼痛[14], 本实验中通过外周给予MDL11939也减轻了疼痛。一般认为，外周伤害性刺激发生时，肠嗜铬细胞释放5-HT，一方面直接激活肠神经系统，另一方面通过初级感受神经元向脊髓中枢传递，在脑内整合，通过脑干下行易化或抑制系统，对脊髓背角5-HT不同的受体亚型进行调控发挥作用。而大量实验研究表明5-HT2AR参与了其中各个环节的调控，腹腔系统性给药，可能是通过减少外周炎性介质降低了外周敏化[1]，也可能是影响了血液循环中炎症介质通过5-HT2AR介导的中枢敏化[15]，但具体的机制仍需要进一步研究。
综上所述，5-HT2AR在疼痛中发挥了重要的调控作用，其激活、表达与疼痛刺激类型、刺激强度均存在一定的相关性，明确其在疼痛中的作用及作用机制，将为临床的疼痛诊疗提供新的靶点和思路。
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