2. 滨州医学院 附属医院院办, 山东 烟台 264003;
3. 滨州医学院 医药研究中心, 山东 烟台 264003;
4. 滨州医学院 基础医学院生物化学教研室, 山东 烟台 264003;
5. 滨州医学院 药理学教研室, 山东 烟台 264003
2. Administrative Office, Yantai Affiliated Hospital, Binzhou Medical University, Yantai Shandong 264003, China;
3. Pharmacy Research Center, Binzhou Medical University, Yantai Shandong 264003, China;
4. Dept of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Yantai Shandong 264003, China;
5. Dept of Pharmacology, Binzhou Medical University, Yantai Shandong 264003, China
创伤后应激障碍(posttraumatic stress disorder，PTSD) 是由于异乎寻常的威胁性或灾难性心理创伤，导致延迟出现和长期持续的精神障碍。PTSD发病机制多样[1]，研究报道PTSD患者海马缩小20%[2]，海马-杏仁核[特别是基底外侧杏仁核(basolateral amygdala, BLA)]间神经环路突触效能的长时程增强(long term potentiation, LTP) 可能是应激导致焦虑的神经基础[3]。目前该病主要有心理和抗抑郁药治疗，而抗抑郁药精神副作用较大，因此探究PTSD的神经生物学机制对寻找治疗靶点具有重要意义。科学家Goodwin于1989年首次成功检测到脑内游离的硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)[4]，主要通过抗炎、抗氧化[5]、抗神经元凋亡[6]、易化海马LTP[7]、抑制谷氨酸的释放、抑制促肾上腺皮质素释放激素的释放[8]等作用发挥着神经功能调控作用。进一步研究也证实，H2S参与学习记忆和情绪调节[9-10]。而学习记忆能力下降和条件性恐惧行为增强是PTSD患者的部分临床症状。那么，PTSD患者海马脑区H2S如何变化？外源性补充H2S是否影响PTSD患者的行为学表现？其机制如何？我们用连续单一应激方案(single prolonged stress paradigm，SPS) 制备大鼠PTSD模型，用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆能力，Western blot技术和亚甲基蓝法检测海马脑区内胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase, CBS)/H2S体系含量，用多管微电极在体细胞外电生理记录海马神经元放电情况，对以上问题进行研究。
1 材料与方法 1.1 实验动物及给药实验选用♂健康成年Wistar大鼠，体质量200 g~300 g，由青岛市药检所动物中心提供。大鼠在实验环境适应性饲养5 d，治疗组于造模前30 min及行为学测试前30 min分别腹腔注射11.2 mg·kg-1 NaHS。正常对照组(normal) 和创伤后应激障碍(PTSD) 组腹腔注射等剂量生理盐水。造模后d 14检测行为学各项指标。
1.2 药品与仪器NaHS和滂胺天蓝购自美国Sigma公司，CBS抗体购自Santa Cruz公司，Micro1401数据采集系统和Spike2数据分析系统购自英国CED公司。
1.3 制备PTSD模型采用2005年日本文部省召开的“基础和临床研究进展”国际会议确定的SPS方案制备大鼠PTSD模型，将大鼠连续进行下述步骤处理：禁锢2 h；强迫性游泳20 min (水深40 cm，水温25℃)；休息15 min后乙醚麻醉，意识丧失后停止麻醉。
1.4 Morris水迷宫实验Morris水迷宫实验是考察海马依赖的空间记忆的最经典实验。圆形水池直径为160 cm，池中可移动平台直径为10 cm，水温为20℃，水深40 cm，池中平台位于水下1 cm。定位航行实验，连续训练5 d，对d 5两轮训练的逃避潜伏期平均值进行分析。空间搜索实验，在d 6训练结束后进行空间记忆测试，动物在平台上停留60 s，后撤除水下平台，计时120 s，计算机自动分析出动物在原平台所在象限的时间百分比及穿越平台位置的次数。
1.5 亚甲蓝法[11]检测脑组织H2S含量造模后d 14行为学测试完成后，麻醉大鼠断头取脑，冰上分离双侧海马，称重后将组织样本匀浆裂解(每毫克组织加10 μL磷酸氢钾缓冲液)。为防止H2S与玻璃结合，整个实验操作过程采用高质量的聚丙烯塑料管作为容器。吸取组织裂解上清(200 μL) 与10 g·L-1醋酸锌混合，可生成硫化锌沉淀。高速离心15 min (20 000×g)，收集沉淀并将沉淀用溶于7.2 mol·L-1盐酸的N, N-二甲基-对苯二胺硫酸盐(20 mmol·L-1)150 μL和溶于1.2 mol·L-1盐酸的FeCl3(30 mmol·L-1)100 μL液体进行溶解。静置15 min后，将200 μL液体转移到96孔板中并用670 nm波长进行吸光度检测。配制NaHS作出标准曲线，计算样品中H2S含量。
1.6 Western blot方法检测脑组织CBS蛋白的表达造模后d 14行为学测试完成后，麻醉大鼠断头取脑，冰上分离出双侧海马，称重后按照每10 mg脑组织加入100 μL裂解液并匀浆，4℃、12 000 r·min-1离心10 min，收集上清，BCA法进行蛋白定量。将样品蛋白用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜上。加一抗(CBS polyclonal antibody) 1 :2 000和二抗(goat anti-rabbit IgG, HRP conjugate) 1 :2 000，ECL显色后在暗室中压片、显影、定影，扫描后用Image J软件分析各条带的灰度值。
1.7 电生理学方法腹腔注射20%乌来糖(1 g·kg-1) 进行麻醉，俯卧位固定于脑立体定位仪上，参照大鼠脑图谱(Paxinos Watson，2005)，海马区的具体坐标为：前囟向后3.6 mm，中线旁开2.5 mm，向下2.3 mm~4.0 mm。记录电极管内注入2%滂胺天蓝，其余两管注入相应药物。打开颅骨脑膜后，用液压推进器将微电极尖端缓慢送至海马，观察细胞放电平稳至少5 min，利用PM2000B型四道压力注射仪通过气体压力将药物注射到神经元表面，通过Micro1401数据采集系统显示细胞放电曲线，用Spike2数据分析系统对细胞放电频率进行分析。以加药前120s内平均每秒放电频率为对照，将加药后反应高峰50 s内平均每秒放电频率作为药物的效应，放电频率超过2倍标准差认为具有统计学意义。
1.8 数据处理和统计学方法计量数据采用x±s，采用SPSS18.0软件进行统计学处理。采用t检验或单因素方差分析(两两比较行LSD检验) 来比较不同组间的差别。SigmaPlot 10.0用于作图。
2 结果 2.1 PTSD模型大鼠空间学习记忆能力降低Morris水迷宫实验中，与正常对照组比较，PTSD组大鼠逃避潜伏期增加(P＜0.01)(Fig 1A)；在平台所在象限停留时间百分比和通过原平台位置次数明显减少(P＜0.01)(Fig 1 B、C)。
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| Fig 1 Escape latency (A), quadrant time %(B) and platform crossing times (C) of Morris water maze in normal and PTSD group ##P < 0.01 vs normal group |
用亚甲基蓝法检测结果如Fig 2所示，与正常对照组相比，PTSD大鼠海马脑区的内源性H2S含量明显降低(P < 0.01)。
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| Fig 2 H2S level of hippocampustissue in normal and PTSD group ##P < 0.01 vs normal group |
大鼠与人的脑组织中H2S主要依赖CBS产生，Fig 2实验结果显示PTSD大鼠海马脑区内源性的H2S水平降低，CBS蛋白表达是否也降低了呢？如Fig 3所示，PTSD大鼠海马脑区CBS的表达水平明显下降(P < 0.05)。
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| Fig 3 CBS level of hippocampus tissuein normal and PTSD group #P < 0.05 vs normal group |
上述结果显示，PTSD大鼠海马组织CBS/H2S体系减少，空间学习记忆能力降低，那么，是否可通过外源性增加H2S的水平来改善PTSD大鼠的空间学习记忆能力呢？Morris水迷宫实验中，与PTSD组比较，PTSD+NaHS组大鼠逃避潜伏期减小(P＜0.01)(Fig 4A)；在平台所在象限停留时间百分比和通过原平台位置次数明显增加(P＜0.01)(Fig 4 B、4C)。
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| Fig 4 Escape latency (A), quadrant time %(B) and platform crossing times (C) of Morris water maze in different group |
为了探讨L-cysteine对整体状态下大鼠海马的电生理效应，我们利用多管微电极进行细胞外电生理记录，观察L-cysteine对海马神经元放电频率的影响。如Fig 5所示，微量压力注射无菌生理盐水前后海马神经元的放电频率差别无统计学意义(P > 0.05)；微量压力注射L-cysteine使海马神经元自发放电频率明显升高(P < 0.01)。
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| Fig 5 Effect of H2S system on frequencyof spontaneous discharges of hippocampus neurons A:Initial graph of frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons; B:Histogram of frequency of spontaneous discharges of hippocampus neurons before and after administration.##P < 0.01 vs before administration |
PTSD动物模型研究发现，经过创伤应激处理后的动物在生理和行为上表现出与PTSD患者很强的相似性，主要有下丘脑-垂体-肾上腺轴系统负反馈抑制增加、听觉惊吓反应增强、条件性恐惧反应持续保存、空间记忆受损等。本实验采用的SPS方案应激动物模型是PTSD行为敏感化常用的应激模式，主要模拟了PTSD患者对创伤线索的惊吓反应增强，此模型所导致的症状可以被抗焦虑药和抗抑郁药所改善，具有良好的预测效度。Morris水迷宫实验是考察海马依赖的空间学习记忆能力的最经典实验，包括定位航行实验和空间搜索实验。本研究采用SPS方案制备PTSD动物模型，采用Morris水迷宫实验中逃避潜伏期、平台所在象限停留时间百分比和通过原平台位置次数等指标来检测大鼠空间学习记忆能力。研究结果显示PTSD组大鼠在Morris水迷宫实验中，逃避潜伏期增加，在平台所在象限停留时间百分比和通过原平台位置次数明显减少，与徐爱军等[12]研究结果一致，均提示PTSD模型大鼠空间学习记忆能力降低。
对人和动物的研究表明，杏仁核、海马与内侧前额叶皮层在PTSD相关症状中具有重要作用。实验研究显示[13]，PTSD模型大鼠海马神经元萎缩、凋亡，甚至海马体积缩小；临床研究发现[2]，PTSD患者海马缩小20%，应激引起的海马损伤不仅可以导致机体处理应激后记忆发生障碍，而且可以引起新的学习记忆过程受损；海马-杏仁核(特别是BLA) 间神经环路突触效能的长时程增强可能是应激导致焦虑的神经基础[3]，也是条件性恐惧的神经基础。故我们研究了PTSD模型大鼠与海马相关的空间学习记忆能力的变化和机制。
H2S是一种新型的气体信号分子，H2S在大脑内含量相对较高(50~160 μmol·L-1)，脑内H2S主要通过CBS分解半胱氨酸形成[14]。生理浓度的H2S在中枢神经系统中发挥着神经功能调控作用。H2S参与学习记忆和情绪调节，进一步研究也证实，抑制H2S合成损伤大鼠海马依赖的情景型恐惧记忆和新物体认知能力，外源性H2S可增强大鼠海马依赖的情景型恐惧记忆和新物体认知[9]。而学习记忆能力下降和条件性恐惧行为增强是PTSD患者的部分临床症状。故我们推测PTSD大鼠海马脑区CBS/H2S体系含量会变化，本实验结果也显示PTSD大鼠海马脑区CBS的表达和H2S的生成均明显低于正常对照组，提示PTSD患者的行为学改变可能与海马脑区CBS/H2S体系受抑制相关。NaHS是一种公认的较常用H2S供体，通过腹腔注射NaHS可以促进脑内H2S水平的升高[11]。本研究通过腹腔注射NaHS研究外源性补充H2S对PTSD大鼠行为学的影响，结果显示NaHS治疗组与PTSD组比较，空间学习记忆能力得到了改善。这与以往研究[8]报道的H2S可改善大鼠的学习记忆能力结果一致。
研究显示，H2S可抑制兴奋性氨基酸的释放，而兴奋性谷氨酸可以调节神经元的兴奋性；内源性H2S可通过cAMP途径增强与认知密切相关的NMDA受体功能，进而促进作为学习记忆分子学基础的海马LTP[7]；H2S通过增强NMDA受体的NR2A亚基功能促进海马LTP来调节海马依赖的情景型恐惧记忆和新物体认知能力[9]。以上的研究均提示H2S可以影响神经元的电生理特性。故本实验利用在体细胞外电生理记录法，观察微量加压注射H2S供体L-cysteine对大鼠海马神经元自发放电频率的影响，与以上文献[7, 9]报道一致，L-cysteine可以影响神经元的电生理特性，主要表现为使海马神经元放电频率升高，产生兴奋效应。结合以上实验结果我们分析，H2S改善PTSD大鼠行为学指标的机制可能与其增加海马神经元放电频率和兴奋性有关。
综上所述，本研究证实海马区CBS/H2S体系的含量与海马依赖性的空间学习记忆能力具有明显的相关性。外源性增加H2S含量可改善PTSD大鼠的空间学习记忆能力，该作用可能与其增加海马神经元放电频率和兴奋性有关。
( 致谢: 本实验在青岛大学生理学教研室和滨州医学院医药研究中心完成。感谢陈蕾、周宇和马春蕾老师的指导与支持。 )
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