肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance，AFC) 对肺脏生理和病理状态下的液体平衡，如肺水肿、急性肺损伤和成人呼吸窘迫症，均起重要的调控作用。增加AFC能加速肺水肿的恢复，改善肺泡上皮的气体交换。相反，减少AFC能降低急性肺损伤和成人呼吸窘迫症病人的生存率，诱发肺水肿的发生^[1-3]。布比卡因是长效酰胺类局麻药，可用于局部浸润麻醉、外周神经阻滞、硬脊膜外阻滞和蛛网膜下腔阻滞。最近的临床报道表明，布比卡因颈丛麻醉及布比卡因过敏均可致急性肺水肿^[4-6]，但具体机制尚不清楚。由于钠离子的转运是肺泡液体清除的重要驱动力，肺泡上皮细胞顶侧膜的上皮钠通道(epithelial sodium channel，ENaC) 是影响AFC的主要决定因素^[3]，我们推测布比卡因可能通过影响位于细胞顶膜侧的阿米洛利敏感性ENaC而影响肺脏液体清除。本研究旨在探讨布比卡因与阿米洛利敏感性电流之间的关系，明确布比卡因是否对肺泡上皮Na⁺转运有抑制作用及其相应的分子机制。

人NCI-H441(H441) 细胞株购自ATCC公司，用添加10%胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培养基(ATCC) 进行培养。阿米洛利及布比卡因购于美国Sigma公司。

取H441细胞株接种于75 cm²的培养瓶中，在37 ℃、含有5% CO₂和95% O₂的湿化气体中孵育生长。将细胞以约5×10⁶/cm²的密度种于Transwell小室(Corning) 中，隔天换液1次，培养7~10 d，使跨间皮阻抗达500 MΩ以上。

按相关文献方法记录H441单层细胞短路电流^[7]。将H441单层细胞置于两侧灌以生理盐溶液(mmol·L^-1：117 NaCl、25 NaHCO₃、4.7 KCl、1.2 MgSO₄、1.2 KH₂PO₄、2.5 CaCl₂、11 D-glucose；pH 7.3~7.4) 的尤斯灌流室(Physiologic Instruments) 中，渗透压在290~300 mOsm。单层细胞两侧持续充以95% O₂和5% CO₂混合气体，所用溶液新鲜配制，预热至37 ℃。跨上皮短路电流采用充以3 mol·L^-1 KCl、4%琼脂糖盐桥的Ag-AgCl电极测定。H441单层细胞短路至0 mV，每10 s给予10 mV脉冲刺激1次，每次1 s，监测跨上皮阻抗和短路电流。短路电流和阻抗达到平稳时，加入1 μmol·L^-1~10 mmol·L^-1布比卡因及上皮钠通道特异性抑制剂阿米洛利于H441单层细胞的顶膜侧，持续记录短路电流和阻抗，直至达到新的平衡。由总电流减去阿米洛利抑制后的电流算得阿米洛利敏感性电流，以用药前H441单层细胞的阿米洛利敏感性电流初始值为100%对照。

H441细胞在37 ℃、5% CO₂条件下培养。用100 μmol·L^-1布比卡因处理H441细胞，在0、15、30、60 min 4个时间点，提取蛋白后，应用10%凝胶进行SDS-PAGE分析。在TBST溶解的5%无脂肪冻干奶粉溶液中孵育1 h后，加入一抗，4 ℃过夜。二抗室温孵育60 min。每次抗体反应后，用缓冲液TBST冲洗3次，每次15 min。本实验所用抗体购自Cell Signaling公司，应用ECL试剂盒(Thermo，SuperSignal) 分析图像。所用抗体的稀释浓度为1 :1 000，研究布比卡因对ERK1/2蛋白磷酸化的影响。

电生理技术用Acquire and Analyse软件进行数据分析(Version 2.3，Physiologic Instruments)。蛋白免疫印迹法用Image J软件进行数据分析。数据结果以x±s表示，数据比较采用单因素ANOVA检验方法进行统计分析。

用不同浓度布比卡因刺激H441细胞单层，并于尤斯灌流室系统上测定其短路电流的变化。如Fig 1A所示，1 μmol·L^-1、10 μmol·L^-1、100 μmol·L^-1、1 mmol·L^-1、10 mmol·L^-1布比卡因能够剂量依赖性抑制人H441单层细胞的短路电流，此电流可被100 μmol·L^-1上皮钠通道特异性抑制剂阿米洛利明显抑制。

由总电流减去阿米洛利抑制后的电流算得阿米洛利敏感性电流，以用药前H441单层细胞的阿米洛利敏感性电流初始值为100%对照。如Fig 1B所示，布比卡因降低阿米洛利敏感性电流的作用随药物浓度增加而增强，其半数抑制浓度为98.1 μmol·L^-1。由此我们推测，布比卡因能够通过降低阿米洛利敏感性电流而抑制ENaC的功能。

Fig 1 Effects of different concentrations of bupivacaine onamiloride-sensitive currents in H441 monolayers A: Representative short-circuit current (Isc) trace showed application of a series of concentrations of bupivacaine from 1 μmol· L-1 to 10 mmol·L-1; B: Normalized amiloride-sensitive currents at each concentration were plotted as a dose-response curve (n=8). The raw data were calculated by fitting with the Boltzmann equation. The IC50 value was 98.1 μmol·L-1

图选项

为了进一步检测布比卡因对ENaC功能影响的分子机制，基于蛋白的磷酸化是许多毒性物质引发的最常见的翻译后修饰现象，以及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK) 与ENaC的密切关系，我们接下来检测了布比卡因改变2种ERK蛋白(ERK1/2) 的磷酸化和去磷酸化之间平衡的可行性。用100 μmol·L^-1布比卡因处理H441细胞，分别于0、15、30、60 min 4个时间点提取蛋白进行磷酸化分析。如Fig 2显示，随着药物处理时间延长，布比卡因能够促进ERK传导通路蛋白磷酸化。Fig 3总结了不同时间点布比卡因对ERK传导通路蛋白磷酸化的影响，可见布比卡因能够在短时间内增强ERK1/2的蛋白磷酸化水平。以用药前蛋白磷酸化水平为100%，15、30、60 min时间点ERK1/2的蛋白磷酸化水平与对照组相比均有明显差异(P < 0.05)。

Fig 2 Effects of bupivacaine on ERK1/2 phosphorylation

图选项

Fig 3 Bupivacaine affects ERK1/2 phosphorylationat different time points (x±s, n=3) *P < 0.05 vs control

图选项

局部麻醉药在围术期的应用非常广泛，因此探讨其对肺功能的影响对于指导临床用药具有重要意义。肺泡Ⅱ型上皮细胞除分泌表面活性物质外，还参与钠的主动运输。钠通过肺泡表面的ENaC (因其对阿米洛利敏感，又称为阿米洛利敏感性钠通道) 进入细胞内，再由位于基底膜的Na⁺-K⁺-ATP酶将其泵入肺间质，同时伴随着水的被动转运，一旦水被转运至肺间质，就形成向肺门的压力梯度，通过淋巴管将水清除出肺。这一过程维持肺泡腔处于相对“干燥”状态，利于气体交换。因此，肺泡上皮Na⁺的主动转运及Na⁺-K⁺-ATP酶的活性对于调节肺泡内的液体平衡，防止肺水肿的发生具有重要作用^[8]。布比卡因是临床最常用的局麻药之一，与其他局麻药相比，布比卡因的治疗浓度与毒性浓度之间的浓度差较小，临床应用时易发生毒性反应。误入静脉或从用药局部吸收过多是布比卡因诱发毒性反应的主要原因^[9]。最近的临床报道表明，布比卡因颈丛麻醉及布比卡因过敏均可致急性肺水肿^[4-6]，但具体机制尚不清楚。已有证据表明，在体情况下通过肺泡上皮的Na⁺主动转运途径在新生儿肺泡液体重吸收以及维持成年肺脏的肺泡腔干燥状态方面发挥重要作用。在人类，肺泡上皮通过主动转运Na⁺来清除多余水分的能力与肺水肿患者的存活率呈正相关^[10]。我们推测，布比卡因可能通过抑制ENaC而降低AFC。

H441细胞是人肺腺癌细胞，为研究ENaC功能活性的经典细胞。本实验运用尤斯灌流室系统，测定H441细胞单层的阿米洛利敏感性钠电流。通过给药前后电流的变化来确定布比卡因对ENaC功能的影响。本研究结果显示，布比卡因能够剂量依赖性抑制H441单层细胞的短路电流，此电流可被阿米洛利抑制。提示布比卡因可能通过抑制肺泡上皮Na⁺转运而降低肺脏液体清除，其机制可能与抑制阿米洛利敏感性上皮钠通道有关。

同时，本实验进一步研究了布比卡因对ERK传导通路蛋白磷酸化的影响。ERK是丝裂原活化蛋白激酶家族成员之一。丝裂原活化蛋白激酶是一组能被不同的细胞外刺激激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程。ERK包括ERK1和ERK2，是将信号从表面受体传导至细胞核的关键因子，磷酸化激活的ERK1/2由胞质转位到核内，进而介导并参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡和细胞的恶变等多种生物学反应。有文献研究表明，ERK1/2与ENaC关系密切^[11-12]，转化生长因子-β1通过ERK1/2通路减少顶膜α-ENaC mRNA的表达^[13]。本实验Western blot结果显示，布比卡因能够促进ERK1/2蛋白磷酸化。以上研究结果表明，布比卡因可能通过激活ERK1/2磷酸化来抑制肺泡ENaC的功能，降低与上皮钠通道有关的阿米洛利敏感性钠电流，阻碍Na⁺的重吸收。其他诸如布比卡因通过抑制心肌细胞钠通道导致心肌抑制而参与肺水肿发生的因素，还需进一步研究。

( 致谢: 本研究的所有工作均在中国医科大学的代谢病分子机制与药物研究所进行。 )