蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs) 广泛分布于中枢神经系统, 并参与神经突触发育、突触可塑性以及一系列的生理、病理过程。在痛觉调控的关键部位--脊髓背角, PTPs的活化也是诱发中枢敏感化的重要机制之一。阻断PTPs的活性, 会有效缓解外周组织损伤诱发的痛觉超敏[1-2]。然而, PTPs家族的成员众多, PTPs的脊髓痛觉调控机制到目前为止尚不清楚。
SHP-2 (Src homology-2 domain-containing phosphatase 2) 是一种重要的非受体型酪氨酸磷酸酶。SHP-2包含2个SH2 (Src homology-2) 结构域以及1个酪氨酸磷酸酶的催化域(PTP区域)。在静息状态下, N末端的SH2结构域会与PTP区域相结合, 使SHP-2处于灭活状态。一旦SH2结构域与其他的酪氨酸磷酸化蛋白相结合, 就会使PTP区域充分暴露, 导致SHP-2的激活[3-4]。
大量的研究显示, 脊髓背角中的代谢型谷氨酸受体(mGluRs) 对中枢敏感化的形成至关重要。mGluRs根据组成的亚基不同, 可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受体[5-6]; 其中, Ⅰ型代谢型谷氨酸受体(包括mGluR1和mGluR5, 合称mGluR1/5) 在痛觉信息传递中的作用尤为关键[7-8]。激动mGluR1/5, 即使在正常动物也会诱发痛觉超敏; 而抑制mGluR1/5, 则会阻断脊髓突触可塑性的形成。本文首次探讨了SHP-2在mGluR1/5介导的痛觉调制中的作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 动物♂成年昆明小鼠, 体质量18~22 g, 由兰州大学实验动物中心提供。
1.2 材料3, 5-dihydroxyphenylglycine (DHPG; Sigma, USA); 8-hydroxy-7-[(6-sulfo-2-naphthyl) azo]-5-quinolinesulfonic acid disodium salt (NSC-87877; Tocric Bioscience, USA); 抗mGluR1抗体(Proteintech, USA); 抗mGluR5抗体(北京博奥森); 抗SHP-2抗体(武汉博士德); pIRES2-EGFP-SHP2(C459S) (Addgene); 辣根过氧化物酶(HRP) 标记二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA); Von-Frey纤维(Stoehing, USA); PVDF膜(Millipore, USA)。
1.3 方法 1.3.1 鞘内给药小鼠四肢固定, 一根25 μL的微量注射器针头沿L5-L6节段棘突间隙插入, 以明显的空洞感及小鼠甩尾作为针头进入蛛网膜下腔的标志, 缓慢推注5 μL的化学药物; 对照组注射5 μL生理盐水。注射完毕后, 轻轻按揉注射部位。采用100 mmol·L-1的polyethylenimine (PEI) 作为转染试剂, 将5 μg的pIRES2-EGFP-SHP2(C459S) 与PEI按照DNA中的P与PEI中N的摩尔比值为1 :10的比例, 轻轻混匀, 室温静置30 min后, 鞘内注射; 对照组转染pIRES2-EGFP。
1.3.2 缩足阈值的测定以Up-Down法测定Von Frey纤维诱发的缩足反应, 通过以下公式计算50%缩足阈值(PWT): 50% PWT=(10[Xf+Kδ])/10 000, 其中δ=0.26; Xf代表最后一个使用的Von Frey纤维的力度值; K代表反应系数(可查表获得)。
1.3.3 免疫共沉淀腹腔注射戊巴比妥钠(60~90 mg·kg-1) 麻醉动物, 行椎板切除术, 快速分离脊髓至4 ℃的人工脑脊液[ACSF, 成分(mmol·L-1): 119.0 NaCl、1.3 MgCl2、1.0 NaH2PO4、2.5 KCl、2.5 CaCl2、26.0 NaHCO3、11.0 D-glucose, pH 7.4, bubbled with 95% O2+5% CO2]中, 剥离软、硬脊膜, 分离L4-L5膨大部脊髓背角。在RIPA缓冲液(50 mmol·L-1 Tris·HCl, pH 8.0, 150 mmol·L-1 NaCl, 1 mmol·L-1 EDTA, 体积分数为0.01的NP-40, 质量浓度为1.0 g·L-1的SDS, 质量浓度为5.0 g·L-1 DOC, 蛋白酶/磷酸酶抑制剂) 中, 制备全细胞匀浆, 4 ℃裂解30 min后, 14 000×g离心10 min; 上清中加入抗mGluR1或mGluR5的特异性抗体, 4 ℃孵育过夜, 加入Protein A+G Agarose beads, 4 ℃孵育3~4 h, 1 000×g离心1 min, 去掉上清, 以RIPA缓冲液清洗3次后, 加入样品缓冲液, 95 ℃煮样5 min, -20 ℃保存。
1.3.4 免疫印迹20 μg蛋白上样, 8% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白, 并印迹于PVDF膜, 5%脱脂牛奶封闭1 h, 用相应蛋白的特异性抗体4 ℃孵育过夜; 洗涤, HRP标记二抗室温孵育1 h; ECL发光试剂盒显像。利用Image J软件进行图像统计分析。
1.3.5 统计学方法实验结果用x±s表示, 采用SPSS软件进行分析, 用One-Way ANOVA结合Post-Hoc Tukey HSD进行统计学检验。
2 结果 2.1 mGluR5能够与SHP-2相结合为探讨mGluR1和mGluR5是否与SHP-2之间存在相互作用, 本实验以抗mGluR1和mGluR5的特异性抗体, 分别从脊髓背角的全细胞匀浆液中进行免疫共沉淀, 通过免疫印迹法检测沉淀物中的SHP-2。结果显示, 抗mGluR5的特异性抗体能够共沉淀SHP-2 (Fig 1A), 但抗mGluR1的特异性抗体却无法沉淀出SHP-2 (Fig 1B), 提示只有mGluR5能够与SHP-2相结合。
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| Fig 1 mGluR5 selectively interacted with SHP-2 (n=6) A: Specific antibody against mGluR5 co-immunoprecipitated (Co-IP) SHP-2 from spinal dorsal horn of adult intact mice. Non-specific IgG was utilized as negative control; B: No SHP-2 was Co-IP by anti-mGluR1 antibody. IB: immunoblotting |
资料显示, 激动脊髓背角的代谢型谷氨酸受体, 会在正常动物中诱发明显的痛觉超敏。既然mGluR5能够与SHP-2相互作用, 我们探讨了mGluR5是否通过SHP-2而起效。为此, 我们将动物分为3组进行实验, Fig 2结果显示: ①对照组: 鞘内注射5 μL的生理盐水, 动物的缩足阈值(PWT) 不会发生明显改变; 30 min后鞘内再次给予5 μL的生理盐水, 也不会对PWT值产生明显影响; ② DHPG组: 鞘内注射DHPG (50 nmol) 之后15 min, 可见动物的PWT值明显降低, 并在第30 min时PWT值降至最低, 提示痛觉超敏的形成[PWT值由(1.68±0.15) g降低至(0.26±0.04) g, P < 0.05]; 此时, 鞘内给予5 μL的生理盐水, 不会对痛觉超敏产生任何影响; ③ NSC-87877组: 鞘内注射DHPG (50 nmol) 后30 min, 再次给予NSC-87877 (6 nmol), 发现NSC-87877作用10min和25min后, 动物的PWT值会明显升高[PWT值由(0.40±0.06) g升高至(1.58±0.19) g和(1.68±0.20) g, P < 0.05], 提示抑制SHP-2的活性, 能够缓解DHPG诱发的痛觉超敏。
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| Fig 2 SHP-2 inhibitor NSC-87877 attenuated the allodynia induced by DHPG in mice (n=6) The paw withdrawal thresholds of intact mice were measured for successive two days, followed by intrathecal injection (i.t.) of saline or DHPG (upward arrow indicated the time point of injection). Thereafter, NSC-87877 or saline was spinally superimposed (as indicated by the downward arrow) to observe the changes of pain thresholds.*P < 0.05 vs saline/saline-injected control mice; #P < 0.05 vs DHPG/saline-injected mice. |
NSC-87877除了抑制SHP-2外, 还可抑制SHP-1等酪氨酸磷酸酶。为特异性探讨SHP-2的作用, 本研究将动物分为3组进行实验, Fig 3结果显示: ①对照组: 脊髓转染GFP对照蛋白, 对动物的PWT值不会产生明显的影响; 转染3 d后, 鞘内给予生理盐水, 也不会明显改变PWT值; ② DHPG组: 脊髓转染GFP对照蛋白后3 d, 鞘内给予DHPG (50 nmol), 会快速降低PWT值, 且这一作用可维持至少45 min[PWT值由(1.87±0.13) g降低至(0.45±0.05) g, P < 0.05]; ③ SHP-2(C459S) 组: 脊髓转染SHP-2的无活性突变体SHP-2(C459S) 以选择性抑制SHP-2, 发现SHP-2(C459S) 本身不会对基础PWT值产生明显影响[PWT值由(1.93±0.04) g转变至(1.96±0.04) g, P>0.05], 但却能够完全阻断DHPG (50 nmol) 诱发的PWT值的降低, 提示激活SHP-2可能是DHPG诱发痛觉超敏的重要机制。
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| Fig 3 The catalytically inactive SHP-2(C459S) mutant ameliorated the allodynia induced by DHPG in mice (n=6) The paw withdrawal thresholds (PWT) of intact mice were measured for successive two days, followed by i.t. of pIRES2-EGFP vectors encoding GFP or GFP-tagged SHP-2(C459S) (downward arrow indicated the time point of injection). Three days later, DHPG (50 nmol) or saline was spinally superimposed (as indicated by the upward arrow) to observe the changes of pain thresholds.*P < 0.05 vs GFP/saline-injected control mice; #P < 0.05 vs GFP/DHPG-injected mice. |
SHP-2是表达在胞质中的蛋白酪氨酸磷酸酶, 广泛参与细胞凋亡、白血病等病理、生理过程。NSC-87877能够与SHP-2的磷酸酶区域(PTP domain) 相结合, 抑制SHP-2的活性[9]。我们的前期研究显示, 鞘内注射NSC-87877能够明显缓解完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant, CFA) 诱发的炎性痛觉超敏[1], 提示外周损伤能够激活脊髓背角中的SHP-2, 使之参与中枢敏感化的形成。但脊髓背角SHP-2的激活机制, 到目前为止尚不清楚。本研究发现, mGluR5可能是SHP-2的上游激活受体, 因为不仅NSC-87877能够缓解DHPG诱发的正常小鼠的痛觉超敏, 而且SHP-2的非活性突变体也能够产生相似的镇痛效应, 提示mGluR5/SHP-2信号通路可能在脊髓痛觉调控中发挥重要作用。
SHP-2包含2个SH2结构域, 1个位于N-末端(N-SH2), 1个位于C-末端(C-SH2); N-SH2会与PTP domain相结合, 抑制SHP-2的催化活性。除了这种分子内的自身结合, SH2还能够与其他酪氨酸磷酸化的膜受体或胞内蛋白发生分子间的结合; 这种结合, 会打断N-SH2与PTP domain的自身结合, 导致SHP-2的构象发生改变, 进而明显增强SHP-2的活性。资料显示, mGluR5是一种Gq蛋白偶联受体, 包含7个跨膜区域、3个胞内大环(intracellular loop) 以及1个胞内C末端序列。其中, 胞内C末端能够与许多蛋白发生相互作用。以抗酪氨酸磷酸化的抗体或mGluR5的抗体进行检查, 发现胞内C末端的多个酪氨酸残基能够被催化磷酸化[10-12], 而mGluR1的胞内C末端却不能够发生酪氨酸磷酸化。本研究结果显示, 抗mGluR5的特异性抗体能够选择性地沉淀SHP-2, 但抗mGluR1的抗体却不能够沉淀SHP-2, 提示mGluR5与SHP-2之间存在密切的功能联系。但其具体的相互作用机制及其对下游信号分子的调控, 尚有待于进一步的深入研究。
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