人体发育过程中, 药物代谢酶(drug metabolizing enzyme, DME) 表达水平发生明显改变, 目前仍然普遍存在, 根据成人药效数据开具儿童用药处方的情况^[1]。儿童不是缩小的成年人, 体内药物处置与成年人之间存在明显差异, 单纯减少剂量给药必将导致灾难性用药事件的发生。从1950年氯霉素治疗儿童患者导致“灰婴综合症”, 到1970年苯甲醇静脉给药治疗早产儿呼吸窘迫综合症导致毒性反应, 甚至死亡, 再到应用西沙比利治疗新生儿胃食管反流导致药物诱导性长QT间期综合症^[2], 其主要原因是对DME个体发育的认知不够充分, 在药物代谢过程中, 很多DME不同亚型的底物具有明显特异性, 调控机制也明显不同^[3]。从胎儿期到成人, DME活性并非呈线性发育, 而是随个体的生长发育发生较大变化, 这些变化对儿童安全用药具有直接的影响, 因此, 了解发育过程中药物代谢酶的变化规律, 对于临床合理用药具有重要的指导意义。

根据个体发育轨迹把DME分为3类: 第一类酶在发育第一阶段表达水平最高, 整个孕期保持不变或者略微下降, 出生后1~2年沉默(FMO1)^[4], 或者保持在相对较低水平(CYP3A7)^[5], 因此, 第一阶段DME在肝脏发育过程中发挥非常重要的功能。第二类酶在整个妊娠过程中保持相对稳定的水平, 出生后1年内表达没有明显改变, 典型的代表酶: CYP3A5、SULT1A1。第三类酶在胎儿期不表达或者表达水平极低, 出生后1~2年明显升高, 到青春期可达成人水平, 例如CYP3A4、FMO3^[6]。

人CYP2C家族包括4个基因CYP2C8、2C9、2C18、2C19, 位于染色体10q24。其编码的酶在成人肝脏占CYP 450总量的0.18, 可氧化代谢临床所用药物的0.29 ^[7]。应用237例孕龄8周~18岁肝脏样本特征性研究CYP2C9及2C19个体发育, 1d~1岁新生儿肝脏CYP2C蛋白表达量可达成人的0.22~0.30, 孕龄8~24周(n=55) 胎儿肝脏样本检测CYP2C9酶表达仅为成人的0.01, 0~5月(n=92) 基本可达成人水平(11.8±7.0) nmol·g^-1, 且呈现明显个体差异^[8]。12~40周胎儿肝脏样本均检测到CYP2C19表达, 微粒体蛋白含量(3.4±2.2) nmol·g^-1(n=71), 且整个孕期无差异。因此, CYP2C19是胎儿肝脏主要表达的DME, 而CYP2C9是成人肝脏主要表达的DME。

CYP3A是P450家族中主要成员, 主要包括CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7、CYP3A43, 位于染色体7q21.1^[9]。CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7含量较高, 3个酶序列同源至少为0.85, 与0.46的临床相关药物氧化代谢相关, CYP3A4在成年人肝脏及肠道表达均高于CYP3A5, CYP3A7是胎儿肝脏中主导代谢的酶类, 表达水平占CYP3A的0.10~0.40。

11例孕期13~40周样本中CYP3A7的表达水平较高, 为289.5 nmol·g^-1, 出生后0~3岁的婴幼儿CYP3A7的表达水平大约下降0.50, 而CYP3A4表达水平稳定升高。12例孕期9~12周胎儿肝脏样本检测结果表明CYP3A7转录水平是CYP3A5的77倍, 且所有样本均检测到CYP3A7蛋白表达, 没有检测到CYP3A4蛋白表达, 仅1例检测到CYP3A5表达。应用CYP3A4特异杂交探针检测12例出生后1周肝脏样本, CYP3A4的转录水平可达到成人0.60, 结果提示CYP3A7主要在胎儿肝脏中表达, CYP3A4主要在出生后肝脏中表达, CYP3A5表达与肝脏发育阶段无明显的相关性^[10-12]。

FMO酶家族基因包括FMO1~4及6P, 位于染色体1q24.3, FMO1~3是代谢外源性的异生质物质主要的酶类^[13]。胎儿及成人FMO1 mRNA、FMO3 mRNA的表达水平存在明显个体差异, FMO1 mRNA的表达水平在胎儿肝脏最高, 肾脏次之, 肺脏与脑组织的表达水平较低; 与之相反, FMO3 mRNA在胎儿肝脏表达水平低, 在成人肝脏中表达水平较高。Yeung等^[14]提出了肝组织中FMO1及FMO3发育转换概念。Koukouritaki等进一步检测了孕龄8周~18岁(n=240) 肝脏中FMO1/FMO3蛋白表达水平, 结果显示: 0.96胎儿肝脏样本均检测FMO1表达, 在孕中、晚期大约下降0.50, 出生后3 d表达沉默, FMO3蛋白表达水平则逐渐升高。

人SULT酶被分为4个亚家族编码7个基因SULT1A1-1A3/4、SULT1B1、SULT1C2、SULT1C4、SULT1E1, 单一基因编码与脑相关SULT4A1^[15]。应用探针研究SULT个体发育, 孕龄14~30周胎儿肝脏(n=30) SULT1酶活性为(0.18±0.12) nmol·min^-1·mg^-1, 成人肝脏酶活性大约增加了3倍。Duanmu等^[16]研究SULT1A1个体发育中蛋白表达, 结果显示胎儿肝脏与出生后0~12月肝组织中表达水平无明显差异; 用探针药物多巴胺研究孕龄18~25周胎儿(n=6) 肝脏、肾脏、小肠、肺组织中SULT1A1酶活性, 结果显示出生后均有不同程度的下降。SULT1A3在孕龄10~22周胎儿(n=31) 肝脏、肺组织表达水平分别为(75.6±52.3) pmol·min^-1·mg^-1、(39.7±18.8) pmol·min^-1·mg^-1, 出生后分别下降10倍、6倍, 这些数据充分解释了SULT1A3在不同组织中表达的复杂性。Hebbring等^[17]确认了SULT1E1蛋白表达从胎儿到成人发育过程中是逐渐降低的, 与年龄呈负相关, 不管是从妊娠初期到晚期, 抑或是出生后的下降趋势, 还是从出生后到年龄较大儿童, 均表现出下降趋势。

在整个发育阶段, 生物利用度的改变、药物与血浆蛋白结合能力及肝脏与肾脏解剖功能改变等多种因素可影响DME表达, 目前对于DME个体发育的调控了解比较局限, 已有证据显示发育过程中核因子孕烷受体(pregnane X receptor, PXR)、组成性雄甾烷受体(constitutive androstane receptor, CAR) 与出生后肝脏中CYP3A4的表达具有相关性, 在调节CYP3A4基因表达过程中发挥重要的作用^[18]。体外实验表明银杏内酯B能够通过激活PXR诱导CYP3A4的表达^[19]。国内外文献报道均已证实CYP3A5^*3多态性可以部分解释经CYP3A代谢的药物清除率的个体差异, 而CYP3A4/A7基因多态性对CYP3A的表型无影响^[11]。经典的遗传学无法解释DME发育表达的个体差异, 因此, 表观遗传调控可能在DME发育过程中发挥重要作用。

最近的研究表明表观遗传的调控主要涉及DNA甲基化、组蛋白修饰与miRNAs调控^[20]。

在哺乳动物, DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的C5末端, 一般而言, 多数DNA甲基化调控作用归因于富含CpG位点, 也称CpG岛, 这些CpG岛多位于基因启动子区, 大约0.70的人类基因已经证实这种模式存在^[21], 然而可变生理性相关的CpG甲基化不单单指发生在CpG岛, 极低密度的CpG基因组区域, 甚至单个的CpG位点在基因调控过程中也发挥重要的作用, CpG二核苷酸高甲基化与基因转录抑制相关^[22]。

Kacevska等^[23]首次详细分析成人肝脏组织中CYP3A4 5′端调控区CpG位点动态甲基化水平高度变异, CYP3A4调控区甲基化修饰调控基因表达, 因此, 近端启动子区的CpG甲基化水平可预测CYP3A4基因表达水平。由于近端启动子不同位点(-1547 bp、-152 bp、-1452 bp)、远端增强子区(xenobiotic-responsive enhancer module, XREM)、基本肝脏增强子调控元件(constitutive liver enhancer module, CLEM4)(-10762 bp), 同时包含了调控CYP3A4的重要转录因子的结合位点: CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein, C/EBP)、肝脏核因子4A (hepatocyte nuclear factor4A, HNF4A)。DNA的甲基化不但可以直接干扰转录因子与识别位点的结合, 也可间接影响辅助阻碍物的招募, 从而影响发育过程中基因的转录。因此, 某种程度上, 这种动态甲基化修饰可以部分解释个体发育中CYP3A4差异表达, 也可能是发育开关的调控机制之一。

Vyhlidal等^[24]应用亚硫酸氢盐测序技术分析48例儿童肝脏及34例胎儿肝脏样本, 检测CYP3A4及CYP3A7 CpG位点的甲基化水平, 结果显示: 与成人肝组织相比, 新生儿CYP3A7近端启动子区胞嘧啶甲基化水平降低; 与新生儿肝组织相比, 成人CYP3A4近端启动子区胞嘧啶甲基化水平明显降低, 进一步证实, 近端启动子区DNA序列胞嘧啶甲基化可能与CYP3A4/3A7 mRNA表达及酶活性改变相关。

DME表观遗传调控相关研究表明, 染色体结构通过组蛋白修饰发生改变, 组蛋白修饰涉及乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等, 这些修饰有助于染色质转录位点的开启和关闭^[25]。在肝脏的发育过程中, 组蛋白的甲基化是发生在组蛋白N端的共价修饰, 在调控基因表达过程中发挥非常重要作用^[26-27], 少部分表观修饰物可增加或去除相应的表观信号发挥对靶基因的调控作用, DNA甲基化酶及去甲基化酶、组蛋白甲基化酶及去甲基化酶、组蛋白乙酰化酶及去乙酰化酶, 还有染色体重塑分子等。

Lu等^[28]用不同发育阶段的C57BL/6小鼠, 研究不同表观修饰因子的表达, 许多表观修饰酶、核小体重塑分子在胎鼠的表达水平明显高于成年鼠, 但是没有呈现明显的组织特异性, 而具有组织特异性的转录因子, 可通过招募表观修饰酶, 激活或沉默染色体, 最终调控组织特异性的基因差异表达。

进一步的研究表明, 组蛋白N端尾部的翻译后修饰导致组蛋白与核小体相互作用的改变, 进而影响染色质结构, 同时影响基因表达能力, 其中组蛋白H3的4位赖氨酸二甲基化(histone 3 lysine 4 dimethylation) 主要出现在比较广泛的区域, 例如启动子、增强子以及远端的调控元件与基因转录的激活有关; 组蛋白H3的27位赖氨酸三甲基化(histone 3 lysine 27 trimethylation, H3K27me3) 与基因转录的抑制有关, 在机体的发育过程中H3K4、H3K27的甲基化发挥双重的开关作用^[29]。

小鼠与人的DNA、蛋白序列高度同源性小鼠的Cyp3a11与Cyp3a16之间的发育转换类似于人CYP3A4与CYP3A7之间的转换, Li等^[30]研究了从胎鼠、新生鼠到成年鼠这几个不同发育阶段Cyp3a不同位点DNA甲基化、组蛋白修饰(H3K4me2、H3K27me3) 动态变化, 结果表明: 在不同阶段Cyp3a基因位点上没有观察到DNA甲基化, 然而在新生鼠肝Cyp3a16与成年鼠肝Cyp3a11表达与H3K4me2降低及H3K27me3升高密切相关, 因此, 通过不同基因位点的组蛋白修饰动态变化, 从而调控Cyp3a16与Cyp3a11表达之间的发育转换。

在肝脏发育过程中CYP3A7与CYP3A4表达转换可能发生在出生后的1~2年。虽然CYP3A4与CYP3A7基因序列有高度的同源性, 在代谢内源性与外源性的物质能力与特异性方面明显不同, CYP3A亚型之间在个体发育过程中的特异性表达有明显的不同, 尤其是儿童与成人之间表现更为明显, 然而控制基因表达的发育转换的机制目前仍然不明确。本研究小组在小鼠CYP3a16与CYP3a11之间发育转换研究基础上, 探究了人CYP3A4/3A7发育转换的问题, 结果表明: 在个体发育过程中CYP3A4/3A7选择性表达与其启动子区组蛋白H3K4me2、H3K27me3动态修饰相关。HNF4A调控成人肝脏中CYP3A4的基础表达及GR调控胎儿肝脏中CYP3A7的表达均发挥决定性作用, 其表观遗传调控机制与HNF4A、GR和CYP3A启动子区及增强子区的高度富集H3K4me2有关。

microRNAs (miRNAs) 是一类小分子非编码RNAs, 通过与靶基因互补配对在转录后水平调控基因表达, miRNAs可调节多种生物进程: 细胞分化、增殖、代谢与凋亡等。miRNAs在不同的发育阶段、不同的组织、不同的细胞、不同的刺激均显示独特的表达模式^[31]。

越来越多的研究表明miRNAs参与转录后调控DME基因CYP3A4与相应的核因子表达。Takagi等^[32]报道miR-148a可调控PXR表达, 间接调控CYP3A4表达; miR-27a和miR-27b可调控RXRa表达, 进一步在转录水平调节CYP3A4表达; 同时, miRNAs之间还可形成网络参与CYP3A4表达调控, 为CYP3A4个体发育差异表达分析提供新的研究方向。目前, 长链的非编码RNAs调节DME基因发育表达的研究是一个全新亟待研究的领域。

大多数DME家族成员既具有第一组的特性, 同时也表现出与第三组类似的特性, “发育开关”被用来描述在胎儿时期明显表达的酶与成人时期高表达酶形式之间的一种转换。CYP3A家族中“发育开关”CYP3A7主要在胎儿肝脏表达水平高, 在成人肝脏中则CYP3A4表达水平高。同样在FMO家族中FMO1及FMO3之间, CYP2C家族中CYP2C19及CYP2C9之间也存在“发育开关”。然而在上述酶类中, 没有确切证据证实在所谓的“胎儿”酶与“成人”酶之间的倒转调控, 如此以来, “发育转换”似乎是对这一过程更贴切的表述, 虽然在某些情况下CYP2C9及CYP2C19在成人肝脏中表达具有类似调控机制, 但是个体发育整个过程中还是具有明显的不同之处。目前, 这些基因的发育转换中还有很多问题, 比如转换时间界限, 是否两个基因协同调节发挥作用, 在某一个时间点基因表达是否发生变化, 是否存在个体差异等。发育开关的表观调控机制则更加复杂, 可能涉及核受体与DME基因特异性调控序列结合, 然后募集多种组蛋白修饰酶, 进而改变与之相结合基因序列的组蛋白修饰状态, 从而达到调控DME基因选择性表达的目的。

综上所述, 更好理解与认知DME个体发育改变, 可以减少儿童用药不良反应事件的发生。表观遗传调控对于DME个体发育发挥至关重要的作用, 发育过程中, 基因表达模式与动态的DNA甲基化与组蛋白可逆性表观修饰密切相关, DNA的甲基化不但可以直接干扰转录因子与识别位点的结合, 也可间接影响辅助阻碍物招募, 从而影响基因转录。组蛋白N端尾部的翻译后修饰导致组蛋白与核小体相互作用改变, 进而影响染色质结构, 同时影响了基因表达能力。我们的研究结果证实人肝脏CYP3A基因亚型发育转换组蛋白修饰调控效应与核受体HNF4A、GR和CYP3A启动子区及增强子区的高度富集H3K4me2有关。长链的非编码RNAs调节DME基因发育表达的研究是目前一个全新的领域, 相关研究进展将影响DME的表达和发育改变, 以期更好预测不同个体对药物代谢能力, 调整相应治疗方案, 有效改善儿童患者治疗效果, 为儿童患者合理、安全、有效用药提供更坚实的依据。