2. 江苏省食品药品监督检验研究院中药室，江苏 南京 210008
2. Mesothecium, Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210008, China
障碍性疾病，具有患病率高、自杀率高、难治愈及复发率高的特点，是全球性公共卫生问题之一。中医认为抑郁症病因病机复杂，近年来中医医家认为肾阳主导抑郁症发生，肾阳不足是抑郁症的基础病机，临床及动物实验表明辅以温补肾阳法治疗抑郁症取得更好的效果。研究表明糖皮质激素及其受体与抑郁症密切相关[1]，且目前肾阳虚抑郁症动物造模方法主要是给予外源性糖皮质激素，本实验试图通过注射氢化可的松建立肾阳虚型抑郁症大鼠模型，从行为学及生理变化多方面评价模型，为进一步开展肾阳虚型抑郁症的病理病机研究及筛选合适的中药治疗肾阳虚型抑郁症奠定基础。
1 材料与方法 1.1 药物及试剂注射用氢化可的松琥珀酸钠粉针剂(天津生物化学制药有限公司，产品批号：021509017，规格10 mg/片)，用生理盐水配成浓度为4 mg·mL-1，对照品盐酸五羟色胺、盐酸多巴胺均购于Sigma公司(批号分别为1001528057、101280875)；重酒石酸去甲肾上腺素、内标替硝唑均购于中国药品生物制品检定所(批号分别为：100169-201103、100336-200402)，苯甲酰氯购于成都科龙化工试剂厂(批号：20120529，分析纯，98%)，甲醇、乙腈为色谱纯，甲酸、乙酸铵、四硼酸钠等均为分析纯，实验用水为超纯水。
1.2 仪器Waters Quattro Micro液质联用仪(美国Waters公司)，色谱工作站：Masslynx4.1；梅特勒-托利多AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Thermo Micro17冷冻高速离心机(美国Thermo公司)；Millipore Driet-Q5超纯水机(法国Millipore公司)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)，游泳缸，自制敞箱，-20 ℃冰箱(海尔)，非接触性红外测试温度计(Vicks)。
1.3 动物及造模方法SPF级健康成年SD大鼠24只，♂，体质量(150±20) g，由南通大学提供，合格证号：(苏)2014-0001SPF级，实验前适应性饲养1周，保持12 h昼夜节律，室温(22±2) ℃，湿度50%，自由摄食饮水。按体质量区间分组法将大鼠随机分为空白组、模型组、自愈组，8只/组，4只/笼。模型组、自愈组大鼠每天14:00左右臀部肌肉注射氢化可的松25 mg·kg-1，连续21 d[2]，对照组大鼠给予等体积的生理盐水。21 d造模结束后，空白组、模型组大鼠眼眶取血0.5 mL，置于肝素钠浸泡过的1.5 mL EP管中，4 ℃，3 000 r·min-1离心10 min，分离血浆于-20 ℃冰箱中备用；隔天处死大鼠，取肝、肾、脾、胸腺、肾上腺、睾丸及附睾称重。自愈组停止给药，正常进食进水，14 d后，同上操作。
1.4 行为学评估 1.4.1 一般四诊指标观察各模型组大鼠实验过程中生长发育情况，精神状态，活动度，毛发，大小便情况等。
1.4.2 大鼠体重、体温检测测定时间为实验前d 0和造模过程中的7、14、21 d，按动物序号进行测量。
1.4.3 糖水偏好[2]实验前1 d，将大鼠单笼适应24 h。d 1：给予每只大鼠2瓶1%蔗糖水；d 2：给予每只大鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶纯净水；d 3：所有大鼠均禁食禁水23 h；d 4：给予每只大鼠事先定量的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶纯净水，1 h后交换两瓶位置，计算大鼠在2 h内的糖水消耗量。
1.4.4 旷敞试验[2]将大鼠放入高40 cm，长、宽均为80 cm，内壁涂黑，底面平均分为25个(16×16) cm2的小方格的箱内底面中心，同时进行摄像和计时，以5 min内大鼠穿越箱底面的方格数为水平得分(三爪以上跨入)，穿越1格得1分；以双前肢抬起次数为垂直得分(两前肢离地1 cm以上)，双前肢离地1次得1分。彻底清洁敞箱后再进行下1只大鼠的观察。
1.4.5 强迫游泳试验[3]将大鼠放入直径40 cm、水深35 cm的桶内，水温25 ℃，适应2 min，累计后4 min内大鼠的不动时间。
1.5 生化指标评估 1.5.1 脏器指数测定[4]解剖动物脏器，称重，计算脏器系数，脏器系数=脏器重量/体质量×100%。
1.5.2 血浆中5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量测定 1.5.2.1 血样处理[3]取血浆100 μL，加入10 μL内标(替硝唑：5.28 mg·L-1)，加入200 μL乙腈，涡旋1 min，12 000 r·min-1离心10 min，将上清液转移至干净的EP管中，依次加入50 μL苯甲酰氯(体积分数为2%的苯甲酰氯溶于乙腈溶液中)及50 μL四硼酸钠缓冲溶液(100 mmol·L-1)，室温下微振10 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清100 μL于进样小瓶中，进样10 μL分析。
1.5.2.2 色谱条件色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)，美国Agilent公司；保护柱：Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，美国Agilent公司；流动相：0.1%甲酸水溶液(含2.0 mmol·L-1乙酸铵) ∶乙腈=35 ∶65；流速：0.2 mL·min-1，柱温：35 ℃。
1.5.2.3 质谱条件多反应检测(MRM)模式；电喷雾正离子化检测(ESI+)；检测电压：3.0 kv；离子源温度：120 ℃；脱溶剂温度：350 ℃；脱溶剂气体流速：450 L·h-1。各成分的检测离子、锥孔电压、碰撞能量见Tab 1。
| Analyte | Ion mode |
Parent /m/z |
Daughter /m/z |
Cone /V |
Coll energy /eV |
| 5-HT | ESI+ | 385.0 | 264.2 | 40 | 25 |
| NE | ESI+ | 482.0 | 105.0 | 30 | 35 |
| DA | ESI+ | 466.1 | 466.0 | 30 | 2 |
| Tinisazole (IS) | ESI+ | 248.0 | 121.1 | 30 | 15 |
利用SPSS 16.0统计软件进行分析处理，统计结果用 (x±s) 表示，组间比较采用单因素方差分析。
2 结果 2.1 大鼠的生活状态造模前各组大鼠发育正常，毛发光泽整齐，无竖毛，大小便正常，行为活跃，对外来刺激反应灵敏。空白组大鼠造模前、后一般状况无明显变化；与空白组相比，模型组大鼠生长发育缓慢，毛发枯燥无光泽，竖毛，泄泻，精神萎靡，对外来刺激反应差，行动迟缓，常蜷缩在角落。
2.2 行为学测试结果造模过程中，模型组大鼠体质量增长缓慢，14 d时，模型组体质量明显低于对照组(P＜0.05)，21 d时，模型组体质量极明显低于对照组 (P＜0.01)，同时模型组大鼠的水平得分、垂直得分、糖水偏好及强迫游泳的不动时间均极明显低于对照组 (P＜0.01)，模型组大鼠体温低于对照组，但无明显差异，见Tab 2。
| Time /d |
Test item | Control group |
Model group |
| 0 | Body weight /mg | 177 | 179 |
| Body temperature/℃ | 35.2 | 35.4 | |
| 7 | Body weight/g | 242 | 235 |
| Body temperature/℃ | 35.0 | 34.9 | |
| 14 | Body weight/mg | 284 | 266* |
| Body temperature/℃ | 36.6 | 36.5 | |
| 21 | Body weight/mg | 324 | 277** |
| Body temperature/℃ | 35.5 | 35.1 | |
| Open-field test | |||
| Level score | 67±13 | 38±18** | |
| Vertical score | 30±10 | 13±8** | |
| Sucrose preference test/% | 69.52±11.85 | 47.97±14.56** | |
| Forced swim test (immobile time)/s |
59.3±14.5 | 111.6±15.78** | |
| *P＜0.05,**P＜0.01 vs control group | |||
♂ SD注射氢化可的松后，肾脏、胸腺、睾丸及附睾指数明显降低(P＜0.05)，脾脏指数极明显降低(P＜0.01)，肝脏指数降低，但变化不明显，肾上腺指数无明显差异，见Tab 3。
| Group | Liver | Kidney | Spleen | Adrenal gland | Thymus | Testis and epididymis |
| Control | 3.77±0.97 | 0.72±0.10 | 0.22±0.01 | 0.02±0.01 | 0.11±0.03 | 1.21±0.13 |
| Model | 3.50±0.24 | 0.66±0.02* | 0.16±0.03** | 0.02±0.00 | 0.08±0.03* | 1.13±0.13* |
| Self-healing | 3.49±0.30 | 0.67±0.08* | 0.16±0.02** | 0.02±0.00 | 0.08±0.01* | 1.12±0.14* |
| *P＜0.05,**P＜0.01 vs control | ||||||
结果表明，与对照组相比，模型组大鼠血浆中5-HT、NE的含量明显或极明显升高(P＜0.05,P＜0.01 )，与模型组相比，自愈组大鼠血浆中5-HT、NE、DA的含量明显或极明显降低(P＜0.05,P＜0.01)，并且自愈组5-HT、DA的含 量明显或极明显低于正常组(P＜0.05,P＜0.01)，而NE含量依然高于正常组。见Tab 4。
| Group | 5-HT/mg·L-1 | NE/mg·L-1 | DA/mg·L-1 |
| Control | 0.06±0.01 | 1.51±0.71 | 0.24±0.04 |
| Model | 0.19±0.13** | 2.20±0.43* | 0.24±0.04 |
| Self-healing | 0.04±0.01*## | 1.63±0.35# | 0.13±0.03**## |
| *P＜0.05,**P＜0.01 vs control;#P＜0.05,##P＜0.01 vs model | |||
中医“证”是祖国医学理论的基本概念，也是实施中医辨证施治的基础，因此建立可靠的动物模型是深入研究疾病的前提之一。本实验采取连续21 d给予SD大鼠肌注氢化可的松25 mg·kg-1，行为学评估结果显示大鼠表现出明显的肾阳虚抑郁状态，如拱背、蜷缩、毛发疏松、无光泽、泄泻、体质量减轻、体温降低，糖水偏好降低，强迫游泳的不动时间明细延长，旷场试验的水平得分和垂直得分明显降低，与实验报道一致[5-8]，已造成肾阳虚型抑郁症模型。
病理学检查结果显示，模型大鼠的肝、肾、脾、胸腺、睾丸及附睾的脏器指数均不同程度的降低，其中脾脏指数下降极为明显，提示氢化可的松可导致大鼠肾脏、脾脏、睾丸等萎缩，生理机能减退、免疫力下降、性功能降低，说明氢化可的松导致大鼠下丘脑-垂体-性腺轴和肾上腺轴-胸腺轴功能紊乱[4, 6, 9]，模型大鼠出现肾阳虚型抑郁症的病理症状，停止氢化可的松刺激14 d后，受影响的脏器未能恢复正常，认为氢化可的松造成的脏器损伤可能是不可逆的。
抑郁症经典的单胺类神经递质和受体假说认为，抑郁症的发生可能与单胺类神经递质功能失衡有关，5-HT、NE、DA被认为与抑郁症发生密切相关。由于5-HT、DA及NE是内源性物质，本实验在参考文献[3]的基础上，采用活性炭预处理后的血浆作为空白血浆，排除了5-HT、NE对实验的干扰，同时大大降低了DA的干扰，保证实验数据更准确可靠。实验结果显示持续注射外源性氢化可的松可引起大鼠血浆中5-HT、NE含量明显升高，与蔡定芳等的研究结果一致[10-12]，且更早研究表明内源性糖皮质激素缺乏时支配中枢单胺类递质的神经兴奋性增高[13-14]，提示长期大剂量注射氢化可的松导致HPA轴功能低下的同时，反馈性激活中枢单胺类神经递质的合成及代谢，大鼠表现出肾阳虚抑郁状态；停止注射氢化可的松14 d后，与模型组相比，自愈组大鼠血浆中5-HT、NE及DA含量下降，并且5-HT、DA含量明显低于正常组，而NE含量依然高于正常组，杨慧敏等[15]对不同中医症型抑郁症进行研究发现，心肾不交型抑郁症5-HT、DA水平低下，NE水平相对亢进，与本实验自愈组结果一致，认为模型大鼠在14 d内不仅未能恢复正常状态，反而由肾阳虚型发展为心肾不交型，病情加重。本研究亦从单胺类神经递质含量角度初步揭示了肾阳虚型抑郁症，若久病不治，肾之精血不足，不能上养心神，最终将可能发展成心肾不交型抑郁症。
( 致谢: 本文实验在江苏省中医院基础药理实验室和临床药理实验室完成，特此致谢！ )
| [1] | 陈姣, 楚世峰, 陈乃宏. 糖皮质激素与抑郁发病相关机制研究进展[J]. 中国药理学通报, 2013, 29 (11) : 1493-5. Chen J, Chu S F, Chen N H. Research progress in glucocorticoid and pathophysiology of depression[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29 (11): 1493-5. |
| [2] | 陈嵘, 秦竹, 吴施国, 等. 桂附地黄丸对肾阳虚抑郁症大鼠行为学改变的影响[J]. 新中医, 2013, 45 (4) : 165-8. Chen Z, Qin Z, Wu S G, et al. Effect of Guifu rehmaniae bolus on the behavior changes of kidney Yang deficiency depression rats[J]. J New Chin Med, 2013, 45 (4): 165-8. |
| [3] | 臧雨馨, 居文政, 孙冰婷, 等. LC-MS/MS法同时测定CUMS大鼠血浆中3中单胺类神经递质[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (2) : 273-8. Zang Y X, Sun B T, Zhao W Z, et al. LC-MS/MS method for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters in rat plasma of CUMS[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (2): 273-8. |
| [4] | 周文江, 姚菊芳, 彭秀华, 等. 肾阳虚证大鼠模型的建立[J]. 实验动物与比较医学, 2007, 27 (4) : 242-3. Zhou W J, Yao J F, Peng X H, et al. Establishment of rat model of kidney deficiency syndrome[J]. Lab Anim Comp Med, 2007, 27 (4): 242-3. |
| [5] | 刘欣, 张冰, 刘小青, 等. 氢化可的松诱导大鼠类阳虚状态的动态观察[J]. 中华中医药杂志, 2011, 26 (1) : 126-8. Liu X, Zhang B, Liu X Q, et al. Dunamic experimental study on rat's analogue yang deficiency syndrome induced by hydrocortisone[J]. Chin J Tradit Clin Med Pharm, 2011, 26 (1): 126-8. |
| [6] | Sturm M, Becker A, Schroeder A, et al. Effect of chronic corticosterone application on depression-like behavior in C57BL/6N and C57BL/6J mice[J]. Genes Brain Behav, 2015, 14 (3): 292-300. doi:10.1111/gbb.2015.14.issue-3 |
| [7] | 彭军波, 季丽莉, 金雪花, 等. 糖皮质激素注射建立小鼠行为抑郁症模型[J]. 解剖学研究, 2012, 34 (2) : 86-8. Peng J B, Ji L L, Jin X H, et al. A mouse model of behavioral depression induced by repeated corticosterone injections[J]. Anat Res, 2012, 34 (2): 86-8. |
| [8] | Kott J M, Mooneyleber S M, Shoubah F A, et al. Effectiveness of different corticosterone administration methods to elevate corticosterone serum levels, induce depressive-like behavior, and affect neurogenesis levels in female rats[J]. Neuroscience, 2016, 312 (15): 201-14. |
| [9] | 沈自尹, 吴志军, 于立华, 等. 淫羊藿总黄酮对皮质酮诱导免疫功能低于大鼠的保护作用及配伍研[J]. 中国药理学通报, 2007, 23 (8) : 1061-3. Shen Z Y, Wu Z J, Yu L H, et al. Study the protection and combination on the total flavones of epimedium to the immunodeficiency rats induced by corticosterone[J]. Chin Pharmacol Bull, 2007, 23 (8): 1061-3. |
| [10] | 蔡定芳, 陈晓红, 刘彦芳, 等. 外源性糖皮质激素对大鼠下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的影响[J]. 中国病理生理杂志, 1997, 13 (6) : 589-92. Cai D F, Chen X H, Liu Y F, et al. The effect of exogenous glucocorticoid on the hypothalamus-pituitary -adrenal-thymus axis in the rats[J]. Chin J Pathophysiol, 1997, 13 (6): 589-92. |
| [11] | 吴勇, 李政木, 卓廉佳, 等. 肾气丸“阴中求阳”配伍对肾阳虚大鼠下丘脑多巴胺及五羟色胺含量的影响[J]. 时珍国医国药, 2009, 20 (10) : 2387-8. Wu Y, Li Z M, Zhuo L J, et al. Influence of compatibility of Shenqi pill “Peinforcing yang from Yin”on the contents of DA, 5-HT in Hypothalamus of Deficient Kidney-Yang rats[J]. Lishizhen Med Mater Med Res, 2009, 20 (10): 2387-8. |
| [12] | 蔡定芳, 沈自尹, 张玲娟, 等. 右归饮对皮质酮大鼠下丘脑单胺类递质含量以及体重饮食摄水的影响[J]. 中国中西医结合杂志, 1995, 15 (12) : 728-31. Cai D F, Shen Z Y, Zhang L J, et al. Effcet of Youguiyin on the content of monoaminie transmitters and body weight, food and fluid intake in corticosteron-rats[J]. Chin J Integr Trad West Med, 1995, 15 (12): 728-31. |
| [13] | Lachuer J, Buda M, Tappaz M, et al. Differential time course activation of the brain stem catecholaminergic groups following chronic adrenalectomy[J]. Neuroendocrinology, 1992, 56 (2): 125-32. |
| [14] | Lachuer J, Buda M, Tappaz M, et al. Lack of glucocorticoids enhances the early activation of noradrenergic cell group triggered by restraint stress[J]. Neuroendocrinology, 1992, 4 (2): 153-9. doi:10.1111/jne.1992.4.issue-2 |
| [15] | 杨慧敏, 李跃华, 杨京, 等. 抑郁症中医辨证分型与外周血神经递质关系研究[J]. 中国中医药信息杂志, 2011, 18 (4) : 14-6. Yang H M, Li Y H, Yang J, et al. Relationship berween TCM syndrome types and peripheral neurotransmitter of major depression patients[J]. Inf Tradit Chin Med, 2011, 18 (4): 14-6. |