2. 广东省心血管病研究所广东省人民医院广东省医学科学院心儿科,广东 广州 510100)
2. Guangdong Provincial Academy of Medicine，Guangdong General Hospital，Guangdong Provincial Cardiovascular Institute，Guangzhou 510100，China
低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是机体长期处于低氧环境下引起血管内皮细胞损伤，血管收缩因子及舒张因子调节失衡，进而导致以肺动脉压力和肺血管阻力升高为特点的临床病理综合征[1]。研究表明，低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α)和低氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factor-2 alpha,HIF-2α)是机体在低氧条件下应对氧气浓度变化的转录因子。低氧条件下，HIF-1α和HIF-2α可以调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、内皮素1(endothelin-1，ET-1)、促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)等基因的表达，在HPH的形成中发挥关键作用[2]。研究HIF-1α和HIF-2α与HPH的关系将有助于临床上对HPH的诊断、预后以及治疗。
1 HIF-1α、HIF-2α的结构和功能 1.1 HIF-1α的结构和功能HIF-1是1992年Semenza等[3]在低氧处理肝细胞癌株Hep3B时发现的一种可调节EPO基因转录的 DNA结合蛋白，是一种氧依赖核转录因子。它主要由HIF-1α和HIF-1β两个亚基单位组成。其中HIF-1β以组成型的形态在常氧和低氧下均可表达，而HIF-1α仅在低氧时表达于细胞核中，是HIF-1的功能亚基单位，决定HIF-1的活性。在常氧下，HIF-1α的氧依赖性降解结构域(oxygen-dependent degradation domain，ODDD)中的特定位点——Pro402和Pro564可与脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase，PHD)结合而发生羟基化，羟基化的ODDD与肿瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau，pVHL)的亲和力增加[4]。pVHL和elongin B、elongin C、Rbx1以及cullin-2共同组成 VCB-Cul2 E3连接酶复合体，使HIF-1α泛素化并通过泛素结合酶途径被降解[5-6]。此外，在常氧下，天冬酰羟化酶(factor inhibiting HIF-1，FIH)可使HIF-α的天冬酰胺残基羟化，从而抑制HIF-1α和环腺甘酸反应元件结合蛋白(P300/CBP)结合并导致其失去转录活性[7]。
在常氧下，HIF-1α通过上述途径被降解，半衰期不到5min，因此其表达难以被检测。而当机体处于低氧环境时，PHDs和FIH丧失活性，羟基化被阻断，HIF-1α蛋白不能通过泛素蛋白酶途径降解而聚集增多，并由胞质向细胞核内转移，与P300/CBP结合形成转录起始复合物，促进低氧相关的靶基因的转录，从而在血管形成、血管运动、细胞增殖、能量代谢方面起作用[8]。
1.2 HIF-2α的结构和功能HIF-2在1997年由Tian等[9]克隆出来，早期研究认为其mRNA几乎只在内皮细胞中表达，因此又称为“内皮PAS蛋白-1(endothelial PAS domain protein 1，EPAS1)”。HIF-2和HIF-1结构相似，是由功能型亚基HIF-2α和结构型亚基HIF-1β组成的异源二聚体。HIF-2α的N端具有能与DNA结合的basic Helix-Loop-Helix(bHLH)结构域和Per-Art-Ser(PAS)结构域，C端含有转录激活作用的反式活化结构域[10]。与HIF-1α类似，HIF-2α可通过脯氨酸羟化酶和天冬酰胺羟化酶羟化途径被降解，因此其活性受含氧水平调节。HIF-2α在机体的血管生长、血管张力调节、铁代谢、能量代谢等方面具有重要作用[11]。
2 HIF-1α、HIF-2α在表达和功能上的异同作为低氧诱导因子家族的两个重要成员，HIF-1α和HIF-2α具有48%的结构同源性，HIF-1α下游部分靶基因如VEGF、EPO、ET-1和NOS等，同时也可以被HIF-2α激活表达。因此它们在调节低氧环境下的机体生理病理反应以及影响低氧相关疾病的发展中具有一定的功能相似性。然而它们的主要功能不能被相互代替。在对下游靶基因的调控上，某些特定基因如BNIP3(BCL2/adenovirus E1B 19 ku protein-interacting protein 3)、CAR9(carbonic anhydrase 9)、LDHA(lactate dehydrogenase A)和PGK1(phosphoglycerate kinase 1)只能被HIF-1α激活，而像NANOG，OCT-4/POU5F1(organic cation/carnitine transporter4/ POU class 5 homeobox 1)和SOX2[SRY (sex determining region Y)-box 2]则只受HIF-2α的调控[11]。另外，HIF-1α几乎在不同动物器官的所有细胞均有表达，而HIF-2α的表达更具特异性，它更多的在一些组织器官胚胎发育时表达，而在成人细胞中的表达量较少。Talks等[13]研究表明，常氧下除巨噬细胞外的正常细胞几乎检测不到HIF-2α的表达，在经过低氧处理后几乎所有细胞内HIF-2α的表达增加。
除了分布差异外，在低氧的不同时间点上HIF-1α和HIF-2α的表达也呈现不同的特点。HIF-1α主要是介导急性期的低氧反应，HIF-2α主要应对慢性低氧期的机体反应。Uchida等[14]在肺上皮细胞A549中研究发现，HIF-1α的mRNA表达在低氧后6~12 h内急速下降，而在同一时间点HIF-2α的mRNA含量明显上升。在蛋白的表达水平上，HIF-1α蛋白在低氧4h被快速激活，6 h开始减少，到12 h时降至基线水平。与之不同，HIF-2α的蛋白水平在4~12 h持续增加。通过在细胞内瞬时转染显性突变体HIF-2α,可阻止慢性低氧下HIF-1α mRNA和蛋白的减少，提示慢性低氧期，HIF-2α可能参与了抑制HIF-1α的表达过程。
在不同的细胞模型中，HIF-1α和HIF-2α对于特定靶基因调控的主导作用不同。Akeno等[15]研究发现在低氧诱导的MG63造骨细胞中，HIF-2α蛋白和VEGF的mRNA表达增加，且HIF-2α的蛋白表达增加先于VEGF的mRNA增加；通过敲除或过表达分别对HIF-1α和HIF-2α进行干预后，发现HIF-2α能增强VEGF启动子的活性且上调VEGF m RNA的表达，而HIF-1α无此效应，提示在MG63造骨细胞中是HIF-2α而非HIF-1α调控了VEGF在低氧下的表达。而吕倩等[16]在探索HIF-1α、VEGF与肺血管重构的关系时发现，低氧下HIF-1α和VEGF的mRNA和蛋白表达同时增加，和肺血管重构呈正线性相关，且VEGF 基因启动子区域有HIF-1α的DNA结合位点，是HIF-1α的一个重要靶基因。在低氧条件下，VEGF能被HIF-1α诱导而转录激活。提示肺组织中HIF-1α在低氧条件下诱导了VEGF的表达，参与了肺血管的重构。
此外，HIF-1α和HIF-2α在不同的细胞中的调控功能也不一样。Ahmad等[17]在不同的细胞模型中研究发现，对于肺动脉内皮细胞(human pulmonary arterial endothelial cells，HPAECs)模型，HIF-2α介导常氧和低氧下HPAECs的增殖，并证明了HIF-1α对HPAECs增殖无明显作用；而在肺动脉平滑肌细胞(human pulmonary artery smooth muscle cells，HPASMCs)中，HIF-1α调控HPASMCs的增殖，HIF-2α则不起作用，提示HIF-2α主要影响内皮细胞的增殖和分化，而HIF-1α主要作用于平滑肌细胞的增殖和分化。Eul等[18]在人肺动脉纤维原细胞(human pulmonary artery fibroblasts，HPAF)中，通过RNA干扰技术研究HIF-1α和HIF-2α的mRNA和蛋白的表达对下游靶基因的调控发现，低氧诱导的HPAF仅由HIF-2α调控而和HIF-1α无关，而细胞迁移则受到HIF-1α和HIF-2α的共同调控。总之，HIF-1α和HIF-2α在功能上既相似，又相互独立，它们在不同细胞之间表达差异的机制目前还不明确，需要进一步研究探索。
3 HIF-1α、HIF-2α和低氧性肺动脉高压 3.1 HIF-1α和低氧性肺动脉高压肺动脉高压的病理学特征主要为肺小动脉中层肥厚，内膜细胞性增生纤维化，进而发展为丛状病变和原位血栓的形成。其中早期的低氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary artery vasoconstriction，HPV)以及后期的低氧性肺血管重建(hypoxic pulmonary vascular structural remodeling，HPSR)是形成肺动脉高压的两个重要的环节。HIF-1α作为体内氧含量稳态调节的主要因子，通过转录激活其靶基因如ET-1、VEGF、诱导型NOS(iNOS)等影响肺动脉高压的发病和病程的进展。Ball等[19]发现敲除HIF-1α的大鼠在低氧环境下血管重塑减轻且肺动脉高压的发病几率降低，提示HIF-1α参与了低氧诱导的平滑肌血管重塑和肺动脉高压的形成。
ET-1是一种强烈的血管收缩活性物质，可引起血管收缩和细胞增生。Zhou等[20]研究发现低氧性肺动脉高压的新生患者血清中ET-1、HIF-1α水平与肺动脉收缩压呈正相关；Wang等[21]进一步研究发现新生大鼠在早期的低氧中ET-1、HIF-1α、肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)的mRNA水平持续上升，随后出现平均肺动脉压增加和肺血管重塑，提示HIF-1α可能通过调节ET-1、ADM的水平来参与新生儿低氧性肺动脉高压的形成。
NO是一种具有强烈扩张血管作用的内源性气体物质，iNOS是体内合成NO的关键限速酶。Hu等[22]研究发现HIF-1α和iNOS在HPH形成的过程中可以相互调节，HIF-1α可以通过转录激活上调iNOS的基因水平，iNOS的蛋白含量和平均肺动脉压以及肺动脉血管重塑呈线性相关。而关于在肺动脉高压中，机体内iNOS和NO的含量变化水平不一致。相关学者认为可能是由于在HIF-1α的诱导作用下，iNOS表达上调，机体反馈性抑制NO的生成，使NO扩张血管作用减弱，进而引起肺血管收缩和肺血管重建[23]。
研究表明，HIF-1α还可通过调控离子通道来影响HPH的形成。慢性低氧下，野生大鼠瞬时受体电位蛋白(transient receptor potential proteins，TRP)TRPC1和TRPC6的mRNA和蛋白水平均显著上升，TRPC1和TRPC6通过钙池操纵钙离子通道(stoer-operated Ca2+ channels)提高细胞内Ca2+离子水平基线，使PASMCs细胞内的Ca2+水平持续上升。在HIF-1α+/-的大鼠PASMCs细胞中，低氧条件下TRPC1和TRPC6的表达以及Ca2+离子基线无明显变化，而在通过病毒转染激活HIF-1α后，TRPC1和TRPC6的水平较常氧组相比显著上升。提示HIF-1α可能通过调控Ca2+通道在HPV的发生中的有重要作用[24]。
3.2 HIF-2α和低氧性肺动脉高压近年来，随着对HIF-1α研究的深入，学者们逐渐把目光转向对低氧诱导因子家族的另一重要成员——HIF-2α的研究。低氧可迅速增加细胞内的HIF-2α蛋白含量，并通过对其下游靶基因的调节，引起内皮细胞的增殖和迁移，进而形成管状结构，导致血管重建和新生，促进肺动脉高压的形成。HIF-2α的下游的靶基因广泛，几乎涵盖了所有的信号通道。Raghavan 等[25]在HPASMCs模型的研究中指出低氧下HIF-2α可通过诱导forkhead boxM1促进肺动脉平滑肌细胞的增殖。Cowburn等[26]提出慢性低氧增加了HIF-2α的稳定性，并通过增加下游靶基因Arginase-1的表达引起肺血管重塑和肺动脉高压。Firth等[27]发现在低氧下，HIF-2α和Oct-4的表达上调，HIF-2α作为Oct-4的上游激活Oct-4的转录，引起肺动脉平滑肌细胞过度增殖。
作为HIFs家族重要的调控因子，PHD2在低氧下对HIF-2α的表达调控是形成HPH的关键因素。Kapitsinou等[28]研究指出其机制可能通过增加EF-1的表达同时减少血管紧张素Apelin受体信号来实现。Dai等[29]通过Tie2Cre条件性敲除大鼠内皮细胞和造血细胞中的PHD2基因，大鼠表现出包含闭塞性肺血管重构和丛状样病变特征的临床型特发性肺动脉高压，而敲除PHD2/HIF-2α的大鼠并没有发现以上症状，其原因可能是PHD2的缺失导致HIF-2α降解减少，后者进一步激活CXC趋化因子配体12(C-X-C motif chemokine ligand 12，CXCL12)引起平滑肌细胞增殖，而同时敲除PHD2/HIF-2α的大鼠未发生肺动脉高压症状，提示HIF-2α在HPH发生发展中可能发挥了关键作用。
在种群水平上，学者们通过对青藏高原上的高海拔适应性人群的全基因研究揭示，该人群对高原低氧环境的适应性和HIF-2α的基因位点选择性有关[30]，Beall等[31]研究发现世代居住在高原的居民体内有突变的EPAS-1(HIF-2α)基因，使其血红蛋白浓度和血细胞比容降低，并通过下游靶基因调节铁代谢和能量代谢等，减轻低氧型血管反应和肺动脉高压的形成。上述研究提示HIF-2α是低氧生理机制的一个重要调节中枢，在多个方面参与了低氧性肺动脉高压的发病和进程。
4 小结和展望低氧刺激引起的细胞增殖和血管重塑是低氧性肺动脉高压形成的始发因素。HIF-1α和HIF-2α作为低氧诱导因子家族的两个重要成员，它们在结构和功能上的差异，使它们作用于不同基因靶点和部位，各自对肺动脉高压的形成和发展起着不可忽视的作用。
近年来，不少已知药物如埃他卡林(iptakalim，IPT)、肺心汤等被证明直接或间接作用于HIF-1α从而对肺动脉高压起疗效。然而作为同样是低氧诱导因子家族的HIF-2α，目前对其在肺动脉高压领域上的研究还较少，HIF-2α的转录机制、上游调控因子、下游效应因子以及其信号通道对肺动脉高压形成的作用机制还不是十分明确，以HIF-2α为中心的机制研究和以HIF-2α作为靶点的药物研究，将有希望在肺动脉高压的治疗上取得新的突破。
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