2. 河北中医学院，河北省心脑血管病中医药防治重点实验室，河北 石家庄 050200
2. Hebei University of Chinese Medicine, Hebei Key Laboratory of Chinese Medicine Research on Cardio-cerebrovascular Diseases, Shijiazhuang 050200, China
TLR4受体已经被证明在脑缺血中发挥着关键的作用[1]。黄芪甲苷可明显减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤中的脑梗死面积，抑制神经细胞凋亡[2]。黄芪甲苷是否通过TLR4/MyD88通路来抑制细胞凋亡？本文以PC12细胞为实验对象，研究黄芪甲苷对缺氧缺糖/复氧复糖PC12细胞TLR4通路的影响，探讨黄芪甲苷抑制细胞凋亡的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 药物和细胞黄芪甲苷购自上海士峰生物科技有限公司，纯度≥98%(生产批号：15010913)，PC12细胞由河北医科大学第一医院科研中心许顺江教授惠赠。
1.1.2 试剂和仪器抑制剂Cli095购自Invivogen公司，TLR4多克隆一抗购自Biovision公司，MyD88单克隆一抗购自CST公司，二抗IgG购自博士德生物有限公司，Caspase-3多克隆一抗和NF-κB多克隆一抗均购自巴傲得生物科技有限公司，普通培养箱3111型和三气培养箱3131型购自赛默尔菲公司。
2 方法 2.1 PC12细胞的造模及实验分组参照Kikuchi等[3]的方法建立缺氧缺糖/复氧复糖细胞模型：移除原培养基换用无糖Earle′s液，随即把培养瓶放入三气培养箱中培养4 h后，换正常培养基放入普通培养箱培养24 h。取对数期PC12细胞，随机分为7组：正常对照组、正常+黄芪甲苷组、缺氧缺糖/复氧复糖组(模型组)、DMSO组、黄芪甲苷组(AST，100 μmol·L-1)、Cli095组(3 μmol·L-1)、黄芪甲苷+Cli095组。第1组正常培养，不进行任何处理。后4组均于造模前0.5 h给药，直至培养结束。第2组在正常培养液加入100μmol·L-1的黄芪甲苷，给药方式同后4组。免疫组化检测caspase-3和NF-κB，Western blot方法检测MyD88和TLR4蛋白表达。
2.2 统计学处理应用SPSS19.0统计软件进行相关数据分析，结果用x±s表示，两组之间比较采用t检验，当资料不服从正态性采用非参数检验。
3 结果caspase-3结果：与正常组相比，正常+黄芪甲苷组没有统计学差异，而模型组阳性细胞数明显增加(P < 0.05)；与模型组相比，DMSO组阳性细胞数没有明显差异(P > 0.05)，但黄芪甲苷组、抑制剂组、黄芪甲苷+Cli095组阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义(P < 0.05)；与黄芪甲苷组比较，黄芪甲苷+抑制剂组阳性细胞数差异无统计学意义(P > 0.05)，而Cli095组增加(P < 0.05)，见Tab 1。NF-κB各组变化趋势与caspase-3相同，见Tab 2。MyD88和TLR4的结果趋势同caspase-3结果相同，见Tab 3，4。
| Group | Dose/μmol·L-1 | Cell quantity |
| Normal | - | 1.00±0.002 |
| Normal+AST | 100 | 1.25±0.50 |
| Model | - | 86.50±1.29# |
| DMSO | 0.001 | 82.00±3.16# |
| AST | 100 | 26.00±5.10* |
| Cli095 | 3 | 50.75±4.65△ |
| AST+Cli095 | 100+3 | 25.00±6.16* |
| #P < 0.05 vs normal; *P < 0.05 vs model; △P < 0.05 vs AST | ||
| Group | Dose/μmol·L-1 | Cell quantity |
| Normal | - | 1.03±0.03 |
| Normal+AST | 100 | 1.25±0.002 |
| Model | - | 85.55±1.33# |
| DMSO | 0.001 | 83.08±2.13# |
| AST | 100 | 25.98±4.32* |
| Cli095 | 3 | 52.15±4.36△ |
| AST+Cli095 | 100+3 | 24.85±5.16* |
| #P < 0.05 vs normal; *P < 0.05 vs model; △P < 0.05 vs AST | ||
| Group | Dose/μmol·L-1 | Gray value |
| Normal | - | 124.33±30.57 |
| Normal+AST | 100 | 118.00±29.61 |
| Model | - | 384.33±26.31# |
| DMSO | 0.001 | 375.00±22.00# |
| AST | 100 | 177.00±54.14* |
| Cli095 | 3 | 291.33±14.98△ |
| AST+Cli095 | 100+3 | 184.67±55.52* |
| #P < 0.05 vs normal；*P < 0.05 vs model；△P < 0.05 vs AST | ||
| Group | Dose/μmol·L-1 | Gray value |
| Normal | - | 77.67±39.31 |
| Normal+AST | 100 | 71.00±36.06 |
| Model | - | 434.33±69.60# |
| DMSO | 0.001 | 427.67±70.40# |
| AST | 100 | 102.67±5.03* |
| Cli095 | 3 | 305.33±86.58△ |
| AST+Cli095 | 100+3 | 136.67±32.65* |
| #P < 0.05 vs normal; *P < 0.05 vs model; △P < 0.05 vs AST | ||
当机体脑缺血/再灌注损伤时，TLR4受体被激活，与细胞内MyD88相结合的同时使信号由细胞外传递到细胞内[4]，并且激活一系列下游反应，最终导致I-κb磷酸化而降解与MAPK家族的激活[5]。前者使NF-κB移位到细胞核内，NF-κB能使TNF-α等炎性细胞因子转录并在细胞中高度表达，大量的炎症瀑布最终导致细胞凋亡[6]。后者激活的MAPK家族使JNK等在细胞中高度表达[7]，部分激活的JNK在胞质中促进细胞色素释放，激活caspase-3等引起细胞凋亡[8]，综上所述，TLR4/MyD88通路机制可以导致细胞发生凋亡。
( 致谢: 本实验在河北中医学院科研中心，在高维娟老师的指导下，周晓红、张颖老师、靳晓飞师弟的帮助下完成。 )
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