缺血性脑血管病(脑缺血)是以脑循环血流量减少为特征的脑血管疾病，具有高发病率和死亡率，严重威胁人类健康。对于脑缺血防治药物的研究至今尚无突破，寻找新型脑缺血防治药物一直是国内外研究热点。脑缺血发生后，神经细胞发生程序性死亡，包括凋亡和自噬(autophagy)[1]。近年来，自噬作用逐渐引起关注。
胸腺素β4(thymosin β4,Tβ4)是由43个氨基酸残基组成的多肽，属胸腺素β家族[2]，与新生血管发生、心肌修复等有关，作为促创伤愈合药物被用于临床[3]。近期多个研究提示Tβ4具有神经保护作用，能减少星形孢菌素引起的运动神经元死亡[4]，减轻兴奋性氨基酸对皮质神经元和整体大鼠模型损伤[5]，改善脑缺血大鼠的神经损伤症状[6]。最新研究认为Tβ4保护作用与促进少突胶质细胞分化和髓鞘生成有关[7]，但Tβ4对神经元凋亡和自噬作用仍不清楚。
氧糖剥夺/复供(oxygen-glucose deprivation and reperfusion，OGD/R)是体外模拟脑缺血的经典模型，可在细胞水平评价药物抗缺血损伤作用[8]。本研究拟采用该模型探讨Tβ4对神经细胞凋亡和自噬的影响。
1 材料与方法 1.1 材料Tβ4购于美国Sigma公司；PC12细胞(pheochromocytoma cells)购于中国医学科学院基础研究所细胞中心；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所,C1063)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(Pierce LDH Cytotoxicity Assay Kit,88953)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)试剂盒(碧云天,S0107)；丙二醛(malondialdehyde,MDA)试剂盒(碧云天S0131)；谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)试剂盒(南京建成生物)；连二亚硫酸钠(sodium dithionite,Na2S2O4)购于美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯，购于华东医药集团有限公司。
1.2 模型制备及分组PC12细胞常规传代培养，在对数生长期以每孔5×104个种板培养24 h，分组处理。造模细胞用含10 mmol·L-1 Na2S2O4的无糖Earle's液孵育4 h作为氧糖剥夺处理，然后换为完全培养基继续培养24 h作为复氧复糖处理。实验分组：正常对照组、OGD/R模型组、OGD/R+Tβ4(0.1、1 、10 mg·L-1) 组。
1.3 检测指标 1.3.1 MTT检测取PC12细胞种板，分为5组：治疗组(终浓度分别为0.1、1、10 mg·L-1 Tβ4)、OGD/R损伤模型组、空白对照组。每孔加20 μL 5 g·L-1 MTT，4 h后去上清，加150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪490 nm波长处检测吸光值(OD)，计算细胞存活率。
1.3.2 LDH检测细胞消化后种板，密度为1×108·L-1。损伤前，加入终浓度分别为0.1、1、10 mg·L-1 Tβ4，设置为Tβ4干预组，同时建立OGD损伤模型组和空白对照组，试剂盒测定LDH活性。
1.3.3 SOD、MDA、GSH-Px检测取各组细胞上清液，按照SOD、MDA和GSH-Px检测试剂盒说明书分别检测并计算其含量。
1.3.4 流式细胞术检测设置对照组(PBS)、Na2S2O4处理给药组(Tβ4浓度梯度0.1、1、10 mg·L-1)，对照组添加PBS，干预组给予不同浓度Tβ4处理6 h，各组OGD/R处理后，细胞悬液离心，按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作。
1.3.5 RT-qPCR检测提取细胞总RNA，进行逆转录实验，Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8软件进行引物设计，上海生物工程有限公司负责合成。Beclin1引物序列：上游5′-GGCAGTGGCGGCTCCTATTC-3′，下游5′-CTGTGAGGACACCCAAGCAAGAC-3′；Atg5引物序列：上游5′-TCAGCTCTGCCTTGGAACATCA-3′，下游5′-AAGTGAGCCTCAACTGCATCCTT-3′。基因相对表达水平以2(Ct内参基因-Ct目的基因)进行统计分析。
2 结果 2.1 Tβ4对OGD/R诱导细胞活力的影响Tβ4和PC12细胞共同孵育24 h后，MTT结果分析表明，中、高浓度Tβ4干预组OGD/R损伤PC12细胞的存活率分别为(48.98±5.22)%、(51.05±12.32)%，均明显高于OGD/R组(36.53±2.21)%。
2.2 Tβ4对OGD/R诱导细胞LDH的影响在OGD/R损伤前后，中、高浓度Tβ4干预组LDH光密度差值分别为(0.84±0.01)、(0.71±0.01)，均低于OGD/R组(0.90±0.01)。
2.3 Tβ4对OGD/R模型氧化应激的影响PC12细胞在OGD/R损伤后，与空白对照组比较，细胞内SOD和GSH-Px活性下降，MDA含量增高；经中、高浓度Tβ4干预后，与OGD/R组比较，SOD和GSH-Px活性增高，MDA含量下降，见Tab 1。
| Group | SOD/kU·L-1 | MDA/μmol·L-1 | GSH-Px/kU·L-1 |
| Control | 0.54±0.04 | 1.43±0.08 | 71.25±2.25 |
| OGD/R | 0.32±0.01** | 2.50±0.14** | 46.17±1.87** |
| Tβ4 0.1 mg·L-1 | 0.37±0.03** | 1.96±0.01**# | 48.98±1.94** |
| Tβ4 1 mg·L-1 | 0.41±0.03**# | 1.69±0.13**# | 54.62±2.01**# |
| Tβ4 10 mg·L-1 | 0.48±0.04# | 1.56±0.05# | 67.31±2.11# |
| **P<0.01 vs control;#P<0.05 vs OGD/R | |||
流式细胞术检测显示，给予不同浓度Tβ4干预均明显改善了OGD/R处理后细胞存活百分率[(26.85±0.61)%、(25.22±0.53)%、(24.75±0.50)% vs.(5.35±0.13)%]，降低了细胞晚期凋亡/坏死百分率[(6.35±0.34)%、(5.50±0.23)%、(12.11±1.35)% vs.(21.83±0.57)%]，并在高浓度Tβ4组中降低了细胞早期凋亡百分率[(58.65±0.94)% vs.(72.03±1.32)%]。
2.5 Tβ4对OGD/R诱导细胞自噬相关基因表达的影响RT-qPCR检测Beclin1和Atg5 mRNA的表达，发现与正常对照组[相对表达量(1±0.07)、(1±0.08)]相比，OGD/R损伤可使Beclin1和Atg5 mRNA的表达增加[(2.25±0.08)、(4.33±0.75)]；中、高浓度Tβ4干预组Beclin1和Atg5 mRNA的表达[中浓度Tβ4干预组(1.79±0.09)、(3.38±0.21),高浓度Tβ4干预组(2.00±0.26)、(3.30±0.59)]均明显低于OGD/R组。
3 讨论脑组织对缺血缺氧均极为敏感，脑缺血一旦发生，脑内能量将很快被耗竭，神经细胞程序性死亡将很快发生[9]，继而导致脑功能受损。已知自噬参与了脑缺氧缺血导致的神经元损伤，但对自噬在脑缺血中的作用却有较大的争议[10-11]。
本研究利用MTT检测和流式细胞术均发现不同浓度Tβ4均能明显减少细胞的坏死和凋亡，有效抑制OGD/R损伤后LDH的上升；抗氧化应激损伤的研究显示，Tβ4呈剂量依赖性提高SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，证实Tβ4有明显OGD/R损伤后抗细胞凋亡的作用。
本研究还发现OGD/R损伤增加Beclin1和Atg5 mRNA表达，提示自噬水平的增加，而中、高浓度Tβ4干预可以明显降低其mRNA表达，我们推测Tβ4保护作用可能与其抑制自噬水平过度升高有关，具体机制有待进一步研究来证实。
综上所述，本研究从多个角度证明了Tβ4对于OGD/R损伤的PC12细胞有较好的保护作用，能抗氧化应激损伤，抑制细胞凋亡，抑制损伤所致自噬水平升高，提示Tβ4可对脑内神经元有直接的保护作用，表明Tβ4对于脑缺血的治疗有着广阔的前景，可为Tβ4对脑缺血损伤的临床前研究提供可靠依据。
| [1] | Huang J, Klionsky D J. Autophagy and human disease[J]. Cell Cycle, 2007, 6 (15): 1837-49. doi:10.4161/cc.6.15.4511 |
| [2] | Goldstein A L, Hannappel E, Kleimnan H K. Thymosin beta 4: actin-sequestering protein moonlights to repair injured tissues[J]. Trends Mol Med, 2005, 11 (9): 421-9. doi:10.1016/j.molmed.2005.07.004 |
| [3] | Guarnera G, DE Rosa A, Camerini R. Thymosin beta-4 and venous ulcers: clinical remarks on a European prospective, randomized study on safety, tolerability, and enhancement on healing[J]. Ann N Y Acad Sci, 2007, 1112 : 407-12. doi:10.1196/annals.1415.003 |
| [4] | Choi S Y, Noh M R, Kim D K, et al. Neuroprotective function of thymosin-beta and its derivative peptides on the programmed cell death of chick and rat neurons[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 362 (3): 587-93. doi:10.1016/j.bbrc.2007.08.031 |
| [5] | Popoli P, Pepponi R, Martire A, et al. Neuroprotective effects of thymosin beta4 in experimental models of excitotoxicity[J]. Ann N Y Acad Sci, 2007, 1112 : 219-24. doi:10.1196/annals.1415.033 |
| [6] | Morris D C, Cui Y, Cheung W L, et al. A dose-response study of thymosin β4 for the treatment of acute stroke[J]. J Neurol Sci, 2014, 345 (1-2): 61-7. doi:10.1016/j.jns.2014.07.006 |
| [7] | Santra M, Chopp M, Zhang Z G, et al. Thymosin β 4 mediates oligodendrocyte differentiation by upregulating p38 MAPK[J]. Glia, 2012, 60 (12): 1826-38. doi:10.1002/glia.v60.12 |
| [8] | 成薇, 沈长波, 王莉, 等. 白藜芦醇预处理对氧糖剥夺/再复氧损伤大鼠皮质神经干细胞增殖的影响[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (1) : 113-8. Cheng W, Shen C B, Wang L, et al. Effect of resveratrol pretreatment on proliferation of cortical neural stem cells after oxygen-glucose deprivation/reoxygenation injury in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (1): 113-8. |
| [9] | Huang X P, Ding H, Wang B, et al. Effects of the main active components combinations of Astragalus and Panax notoginseng on energy metabolism in brain tissues after cerebral ischemia-reperfusion in mice[J]. Pharmacogn Mag, 2015, 11 (44): 732-9. doi:10.4103/0973-1296.165572 |
| [10] | Rabinowitz J D, White E. Autophagy and metabolism[J]. Science, 2010, 330 (6009): 1344-8. doi:10.1126/science.1193497 |
| [11] | Rubinsztein D C, DiFiglia M, Heintz N, et al. Autophagy and its possible roles in nervous system diseases, damage and repair[J]. Autophagy, 2005, 1 (1): 11-22. doi:10.4161/auto.1.1.1513 |