2. 动物科学技术学院;
3. 食品科学技术学院，黑龙江 大庆 163319
2. College of Animal Science & Veterinary Medicine ;
3. College of Food Science & Technology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing Heilongjiang 163319,China
醌茜素是一种具有高效性、高选择性和细胞能透性的药物。虽然醌茜素能够有效抑制前列腺癌细胞的增殖[1]，但醌茜素对肺癌细胞的作用机制尚不清楚。本文研究了醌茜素对人肺癌A549细胞周期及细胞凋亡的影响，并初步探讨其机制。
1 材料与方法 1.1 材料3种人肺癌A549、NCI-H23、NCI-H460细胞株及正常肝QSG-7701细胞株(上海中科院细胞库)；醌茜素(上海绿鸟科技发展有限公司)；5-Fluorouracil(上海皓元生物医药科技有限公司)；RPMI 1640(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；MTT(美国Amresco公司)；DMSO(美国Sigma公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；HRP标记山羊抗兔、抗鼠IgG(美国Santa Cruz公司)；ECL化学发光试剂(美国Thermo公司)；CO2培养箱(日本SanYo公司)；FACSCalibvr型流式细胞仪(美国BD公司)；电泳仪、半干转印仪(美国Bio-rad公司)；MicroChemi4.0型化学发光型凝胶成像系统(DNR公司)。
1.2 方法采用MTT比色法检测3种人肺癌A549、NCI-H23、NCI-H460及正常肝QSG-7701细胞的存活率，对照药物为5-FU。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测醌茜素处理A549细胞后凋亡情况。通过流式细胞术检测细胞周期阻滞情况和细胞凋亡数量的变化。通过蛋白质免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白表达量变化及细胞凋亡相关信号通路。
1.3 统计学方法数据统计采用SPSS 19.0统计分析软件进行分析，实验数据以x±s表示。
2 结果 2.1 醌茜素对人肺癌细胞存活率的影响结果显示，不同浓度(0、1、3、10、30、100 μmol·L-1)的醌茜素均对人肺癌(A549、NCI-H460及NCI-H23)细胞的生长有抑制作用(P<0.01)，呈剂量依赖性，而且对正常肝QSG-7701细胞无明显毒性作用，说明醌茜素对3种人肺癌细胞均具有明显的增殖抑制作用。
2.2 醌茜素对人肺癌A549细胞周期的影响结果显示，用9.9 μmol·L-1醌茜素处理细胞0、3、6、12、24 h后，当处理时间为24 h时，使A549细胞阻滞于G0/G1期。随后，蛋白质免疫印迹法结果显示，细胞周期G0/G1期相关蛋白CDK2、CDK4、CDK6、Cyclin D1、Cyclin E的表达量均逐渐减少，与对照组相比差异有显著性(P<0.01)，说明醌茜素通过调控人肺癌A549细胞周期相关蛋白的表达，诱导A549细胞G0/G1期的阻滞。
2.3 醌茜素对人肺癌A549细胞形态的影响结果显示，对照组(0 h)细胞生长贴壁较牢固，细胞膜边界完整。随着处理药物时间(0、3、6、12、24 h)的延长，细胞形态发生明显的变化，细胞发生皱缩，变圆，出现类似细胞凋亡的特征。通过荧光显微镜观察发现，随着药物处理时间的延长，Annexin V-FITC和PI的荧光强度逐渐增强，与阳性对照组(5-FU处理组)相比差异有显著性(P<0.01)。
2.4 醌茜素对人肺癌A549细胞凋亡的影响通过9.9 μmol·L-1醌茜素处理细胞0、3、6、12、24 h后，流式细胞术结果显示，死细胞比例未见明显升高，而细胞早期凋亡及晚期凋亡的百分率随着处理时间的增加出现明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。随后，蛋白质免疫印迹法结果显示，p-Akt、p-p38、Bcl-2、procaspase-9及procaspase-3等蛋白的表达量逐渐减少，p-p53、Bad、cleaved caspase-3及cleaved PARP等蛋白的表达量逐渐增加(P<0.01)，说明醌茜素通过调控Akt、p38及p53信号通路诱导人肺癌A549细胞发生凋亡。
3 讨论肺癌是预后最差的恶性肿瘤之一[2]。目前，临床上的抗肿瘤药物多数具有价格昂贵、毒副作用强等缺点，因此，寻找高效、低毒的抗肿瘤药物成为国内外研究的热点。醌茜素是一类蒽醌类化合物，对多种癌细胞均具有抑制增殖的作用。本实验通过MTT比色法验证了醌茜素能够抑制3种人肺癌细胞增殖[3]；通过流式细胞术和Western blot[4]实验验证了醌茜素通过调节G0/G1期周期蛋白的活性和表达，阻滞细胞周期进程，从而抑制A549细胞的增殖，并能通过Akt、p38及p53蛋白信号通路诱导人肺癌A549细胞的凋亡。
( 致谢: 本实验是在分子病理与药效学实验室完成，衷心感谢对实验给予帮助的老师和同学！ )
| [1] | Schneider C C, Gtz C, Hessenauer A, et al. Down-regulation of CK2 activity results in a decrease in the level of cdc25C phosphatase in different prostate cancer cell lines[J]. Mol Cell Biochem, 2011, 356 (1-2): 177-84. doi:10.1007/s11010-011-0946-7 |
| [2] | 刘灿, 蔡天宇, 赵晓萌, 等. 罗汉果提取物诱导肺癌细胞A549凋亡的研究[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (9) : 1310-4. Liu C, Cai T Y, Zhao X M, et al. Apoptosis effect of Siraitia grosvenorii extracts on lung cancer cells A549 and its mechanisms[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (9): 1310-4. |
| [3] | 李梦姣, 顾振纶, 董丽霞, 等. 蓝萼甲素对人肺癌A549细胞的作用及其机制[J]. 中国药理学通报, 2013, 29 (6) : 882. Li M J, Gu Z L, Dong L X, et al. Effects of glaucocalyxin A on human lung cancer A549 cells and its mechanism[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29 (6): 882. |
| [4] | 钟良瑞, 魏克民. 三叶青黄酮对肺癌A549细胞生长抑制与MAPKs通路关系的研究[J]. 中国药理学通报, 2014, 30 (1) : 101-4. Zhong L R, Wei K M. Radix tetrastigma hemsleyani flavone suppresses human lung carcinoma A549 cell by regulating MAPKs pathway[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30 (1): 101-4. |