2. 上海市生物物质成药性评价专业技术服务平台，上海 200437;
3. 上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室，上海 200437
2. Shanghai Professional and Technical Service Center for Biological Material Druggability Evaluation, Shanghai 200437,China ;
3. StateKey Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 200437,China
器官移植引起的排斥反应可分为3个阶段，即移植物抗原使宿主致敏的感应阶段、宿主T细胞被激活的增殖分化阶段和移植物被宿主免疫系统攻击、破坏的效应阶段。整个移植免疫应答过程是一个T细胞依赖的免疫反应[1-2]，其中心环节在于T细胞的活化、增殖。针对器官移植引起的排斥反应，临床上通常会采用免疫抑制剂来进行抗排异治疗[3-4]。环孢素A (cyclosporine A，CsA) 是目前应用最为广泛的免疫抑制剂之一，它可以有效地降低移植患者术后急性排斥反应的发生。环孢素A的免疫抑制效应主要是通过对移植免疫应答中T细胞激活过程的抑制来实现，同时对效应阶段和体液免疫也有一定作用。
目前，皮肤移植模型大多采用背部皮肤移植和尾部皮肤移植[5-6]。背部皮肤移植和尾部皮肤移植对于供体皮肤取材的手术要求较高，不同动物之间所取皮肤的均一性较差，且容易感染。本实验采用耳部皮肤移植到小鼠背部的方法建立皮肤移植模型，具有操作简单快捷、不同动物间均一性好、不易感染、移植皮肤生长状态好、易存活等优点，并选用环孢素A作为阳性对照药，以移植排斥评分、移植皮肤存活率、动物体重变化、皮肤移植小鼠血清中IL-4、 IFN-γ、IL-12的含量、胸腺和脾脏系数、脾脏T细胞中CD4+和CD8+细胞比例以及移植皮肤的病理等为评价指标，对耳-背皮肤移植模型的特点进行分析，同时对环孢素A的药效进行评价。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物SPF级BALB/c小鼠55只(♀小鼠25只，♂小鼠30只，其中5只♂小鼠作为同种皮肤移植手术的供体小鼠)，SPF级C57BL/6♂小鼠20只，体质量18~20 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(沪)2013-0016 。
1.1.2 药品与试剂环孢素A注射液购自诺华制药有限公司(批号：S0060A)。小鼠IL-4 、IFN-γ和IL-12 ELISA 试剂盒购自美国Sigma公司(批号分别为：0119C0410、0727B0421、0709C0437)。抗小鼠CD4抗体和CD8抗体购自美国BD Biosciences公司(批号分别为3248572、553030)。
1.2 方法 1.2.1 小鼠皮肤移植模型的建立根据参考文献[7]，BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠经戊巴比妥钠(40 mg·kg-1)麻醉后，用体积分数为0.75的乙醇对供体小鼠的耳朵和受体小鼠的背部皮肤进行消毒。将供体小鼠的耳朵从根部取下，置于冰冷的无菌PBS中备用。将受体小鼠背部一侧皮肤的表皮剪下(直径约1 cm)，将供体小鼠的耳朵内外侧皮肤分离，取内侧皮肤，分离面朝下，贴到受体小鼠背部创口处，用剪刀将未完全吻合的皮肤进行剔除修理，接着用无菌创口贴包扎，再用丝线将创口贴缝合固定。4 d后，将创口贴轻轻剪下，暴露移植部位，对移植排斥反应进行评价。在本实验中，异种皮肤移植(allograft)将C57BL/6小鼠皮肤移植到BALB/c小鼠身上，同种皮肤移植(isograft)将BALB/c小鼠皮肤移植到BALB/c小鼠身上。将BALB/c小鼠分为5组，每组10只，♀♂各半，其中4组小鼠接受异种皮肤移植，1组小鼠接受同种皮肤移植。
1.2.2 药物配制及给药移植当天计为d 0，开始给药，每天1次，直至d 12，将环孢素A注射液根据给药剂量用生理盐水进行稀释。环孢素A高剂量组给药量为40 mg·kg-1，中剂量为20 mg·kg-1，低剂量为10 mg·kg-1。给药方式采用尾静脉注射，空白对照组注射生理盐水。
1.2.3 移植排斥评分(graft rejection score)和移植皮肤存活率(graft survival rate)的计算 1.2.3.1 移植排斥评分根据文献[8]，将移植后皮肤的排斥反应分为0~5级，对应移植排斥评分0~5分(Fig 1、Tab 1)。
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| Fig 1 Scores to characterize mouse skin graft rejection A:Score 0;B:Score 1;C:Score 2;D:Score 3;E:Score 4;F:Score 5 |
| Score | Graft rejection |
| 0 | Intact graft |
| 1 | First clear signs of graft rejection |
| 2 | >25% |
| 3 | >50% |
| 4 | >75% |
| 5 | Complete rejection(>95%) |
| Rejection is described as percentage of total graft area. Any artificial lesion,e.g. by the suture or suture material,or any trauma is excluded from evaluation. | |
当皮肤移植排斥级别达到5级时，我们定义为移植的皮肤死亡，并根据出现5级排斥的动物数量，计算移植皮肤存活率。移植皮肤存活率/%=(每组总动物数-排斥评分5级动物数)/ 每组总动物数×100%。
1.2.4 血清中IL-4、 IL-12和IFN-γ含量的测定小鼠眼内眦采血，离心取血清，分装后冻存于-80℃冰箱。测定前，融化后按照ELISA试剂盒的说明书对血清中的IL-4、IL-12和IFN-γ的含量进行测定。
1.2.5 CD4+和CD8+细胞比例分析 1.2.5.1 小鼠脾淋巴细胞分离迅速脱颈椎处死小鼠，用体积分数为0.75的乙醇浸泡消毒(2~3 min)。在超净工作台中，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，除去其周围的脂肪组织，并用Hank's试剂淋洗1~2次，转入放有Hank′s试剂的无菌玻璃培养皿中(培养皿冰浴)。将脾脏置于200目筛网上用剪刀剪碎后，倒入Hank′s试剂冲洗，得到脾脏细胞悬液。将细胞悬液离心10 min(1 000 r·min-1)，弃上清，再加入2 mL 裂红液(ACK lysis buffer)裂解红细胞3~5 min，加入5 mL RPMI 1640培养液(或者Hank′s试剂)离心10 min(1 000 r·min-1)，沉淀用Hank′s试剂冲洗2次，再用含体积分数为0.1胎牛血清的RPMI 1640培养液调节细胞至所需浓度。
1.2.5.2 CD4+和CD8+细胞计数将脾淋巴细胞浓度调整为5×109·L-1，取每个待测样品100 μL，向待测样品中分别加入2.5 μL CD4抗体、1 μL CD8抗体、2.5 μL CD3抗体，同时设立空白对照组(不加任何抗体)、CD3对照(只加CD3抗体)、CD4对照(只加CD4抗体)、CD8对照(只加CD8抗体)，各对照组需加入一定体积的培养基来保证样品总体积的一致。混匀后，室温下避光孵育30 min，用流式细胞仪对CD4+和CD8+细胞数进行测定。
1.2.6 脏器系数计算小鼠处死后，解剖，取胸腺和脾脏称重，利用公式：脏器系数=脏器重量(g)/体质量(100 g)，计算脏器系数。
1.2.7 病理组织学检查将移植皮肤取下，用体积分数为0.04的甲醛固定，石蜡包埋、切片、HE染色后进行病理切片观察。参考文献[8]，与皮肤移植排斥评分方法一致，将移植皮肤坏死情况进行病理学评分，评分方法见Tab 2 。
| Score | Skin necrosis |
| 0 | Intact skin |
| 1 | First clear signs of skin necrosis |
| 2 | >25% |
| 3 | >50% |
| 4 | >75% |
| 5 | Complete necrosis(>95%) |
采用Graphpad Prism 5.0软件进行统计处理，计量资料采用x±s表示，两组间比较采用t检验，多样本均数采用单因素方差分析(One-way-ANOVA)。
2 结果 2.1 移植排斥评分由Fig 2可以看出，同种皮肤移植小鼠未出现明显的移植排斥反应，手术后d 12受体小鼠皮肤生长良好，说明移植手术成功，其他实验操作对移植皮肤的生长未见明显影响。空白对照组小鼠d 6开始观察到移植排斥反应，随着时间的延长，移植排斥反应评分逐渐增高，在d 12，移植排斥评分基本达到5分。环孢素A可抑制移植排斥反应，与空白对照组相比，40 mg·kg-1环孢素A能有效地抑制移植排斥反应，20 mg·kg-1环孢素A能一定程度地降低移植排斥反应，10 mg·kg-1环孢素A对移植排斥有一定的抑制作用，但抑制作用不明显。
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| Fig 2 Dose-response and time-course of effect of cyclosporine A on graft rejection scores(±s,n=10) **P<0.01 vs saline group |
由Fig 3所示，同种移植组小鼠皮肤100%存活，说明移植手术成功，各种实验操作对皮肤移植存活率无明显影响。异种移植小鼠，d 8开始出现移植皮肤死亡现象，至d 12，异种移植空白对照组小鼠的皮肤全部死亡。给予环孢素A进行治疗，每天1次，连续给药至d 12。结果表明，40 mg·kg-1环孢素A能明显减少小鼠皮肤移植引起的排斥反应，使移植皮肤的存活率达到100%，20 mg·kg-1环孢素A能使移植皮肤存活率达到83.35%，而10 mg·kg-1的环孢素A能一定程度地抑制因排斥引起的移植皮肤死亡，12 d后移植皮肤存活率为25%。 皮肤存活率是评价免疫抑制剂在皮肤移植手术中抗排斥反应有效性的重要指标。实验结果表明，高剂量环孢素A免疫抑制作用能达到100%，中剂量环孢素A对移植排斥的抑制效果为83.35%，而低剂量环孢素A虽然能起到一定的免疫抑制作用，但可能并不能达到临床所需的治疗效果。
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| Fig 3 Dose-response and time-course of effect of cyclosporine A on graft skin survival rate(x±s,n=10) **P<0.01 vs saline group |
由Fig 4可以看出，低、中、高剂量的环孢素A连续尾静脉给药对♀♂小鼠的生长均存在抑制作用，且存在一定剂量依赖性，其中40 mg·kg-1环孢素A对小鼠生长的抑制作用最为明显。
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| Fig 4 Effects of different doses of cyclosporine A on body weight of male mice (A) and female mice (B)(x±s,n=5) |
IL-4属于抗炎因子，在器官移植手术中，IL-4的血清水平不应该有明显的变化。在本实验中，取手术(给药)后d 4和d 9的受体小鼠血清，用ELISA试剂盒测定血清中IL-4的含量。结果见Fig 5A，和同种移植组相比，空白对照组小鼠血清中的IL-4均未见明显增加。同样，和空白对照组相比，环孢素A各剂量组小鼠血清中的IL-4含量也未出现明显的变化。
手术(给药)后d 4，和同种移植小鼠血清中IL-12水平相比，空白对照组小鼠血清中的IL-12含量明显增加(P<0.01)；10 mg·kg-1的环孢素A在给药后d 4未能明显降低血清中IL-12的含量，20、40 mg·kg-1的环孢素A在给药后d 4均能明显降低血清中IL-12的含量。在手术(给药)后d 9,与同种移植组相比，空白对照组小鼠血清中的IL-12明显增加(P<0.01)，10 mg·kg-1的环孢素A未能明显降低血清中IL-12的含量，而20 mg·kg-1和40 mg·kg-1的环孢素A在d 9均明显降低了血清中IL-12的含量(P<0.01)，且剂量依赖性良好(Fig 5B)。
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| Fig 5 Effects of cyclosporine A on serum IL-4 (A),IL-12 (B) and IFN-γ (C) levels of mice(x±s,n=10) **P<0.01 vs saline group |
手术(给药)后d 4，和同种移植组相比，空白对照组小鼠血清中的IFN-γ明显增加(P<0.01)，环孢素A在低、中、高给药剂量下均能明显降低皮肤移植受体小鼠血清中IFN-γ的含量(P<0.01)，且呈现出很好的剂量依赖性。在手术(给药)后d 9，和同种移植组相比，空白对照组小鼠血清中IFN-γ水平明显增加(P<0.01)。低、中、高剂量的环孢素A在d 9均能明显降低小鼠血清中IFN-γ的含量，且存在很好的剂量依赖性(Fig 5C)。
2.5 CD4+和CD8+细胞比例手术(给药)后d 12，取脾细胞进行CD4+细胞计数，与同种移植组小鼠CD4+细胞百分比相比，异种移植组小鼠未见明显变化，给药后3个剂量组的CD4+细胞比例也无明显差别(Fig 6A)。对于CD8+细胞，在手术(给药)后d 12，与同种移植组小鼠相比，空白对照组小鼠脾脏CD8+细胞比例明显增加(P<0.05)。40 mg·kg-1环孢素A组小鼠脾脏CD8+细胞比例较空白对照组明显降低(P<0.05)，10、20 mg·kg-1环孢素A剂量组小鼠脾脏CD8+细胞出现下降的趋势，但差异无显著性(Fig 6B)。
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| Fig 6 Effects of cyclosporine A on CD4+ (A) and CD8+ (B) population of splenic T cells(x±s,n=7) The isolated splenic cells with low concentration(less than 5×109·L-1) were excluded from the analysis. *P<0.05 vs saline group;#P<0.05 vs isograft group. |
手术(给药)后d 12，和同种皮肤移植组小鼠相比，空白对照组小鼠胸腺系数无明显增加。随着环孢素A剂量的增加，小鼠胸腺系数逐渐减小，并呈现剂量依赖性，但和空白对照组相比差异均无显著性(Fig 7A)。和同种皮肤移植组小鼠相比，空白对照组小鼠脾脏系数有一定程度的增加，但差异无显著性。随着环孢素A剂量的增加，小鼠脾脏系数逐渐减小，并呈现剂量依赖性，但和空白对照组相比，差异均无显著性(Fig 7B)。
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| Fig 7 Effects of different doses of cyclosporine A on thymus index (A) and spleen index (B)(x±s,n=10) |
手术(给药)后d 12，将移植皮肤取下，石蜡包埋切片，HE染色后，进行病理学观察，并进行皮肤坏死程度评分。如Fig 8所示，空白对照组和10 mg·kg-1环孢素A给药组移植皮肤组织表皮下见一细长伊红色条状异物与表皮平行排列分布，异物中间充满大量大小不一的圆形空白结构。异物上方皮下结缔组织中有大量炎症细胞浸润，主要为淋巴细胞和部分中性粒细胞，组织水肿疏松，上方表皮层鳞状细胞基本坏死(>95%)，部分脱落形成表皮溃疡。异物下方有较多炎症细胞沿异物呈带状集聚，局部有灶性炎症细胞坏死，形成微小脓肿，中央坏死使组织分离呈小空腔。在下方深部皮下脂肪结缔组织及肌层有较大量炎症细胞广泛浸润。20 mg·kg-1环孢素A给药组移植皮肤组织也存在长条状异物，异物上下两侧皮下组织有部分淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，组织结构疏松。两端表皮鳞状细胞层尚保存，中间局部上皮也存在坏死脱落溃疡(>50%)，但相对于空白对照组和低剂量环孢素A给药组，脱落溃疡程度较轻。40 mg·kg-1环孢素A给药组和同种皮肤移植组移植皮肤组织皮下长条状异物不明显，异物上下两侧皮下组织有轻度炎症细胞浸润或者无炎症细胞浸润，组织结构较紧密，表皮鳞状细胞层完整保存。 对皮肤坏死程度进行病理评分，如Fig 9所示，同种移植组和40 mg·kg-1环孢素A给药组移植皮肤病理评分较低，移植皮肤无明显坏死，与空白对照组相比，差异存在显著性。
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| Fig 8 Effects of cyclosporine A on pathology of graft skin(×100) A:Saline;B:10 mg·kg-1 CsA; C:20 mg·kg-1 CsA; D:40 mg·kg-1 CsA; E:Isograft |
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| Fig 9 Effects of cyclosporine A on pathological scores of necrosis and inflammation(x±s,n=10) **P<0.01 vs saline group |
器官移植是现代医学治疗的重要手段之一，临床常见的移植器官有肾、肝、心、角膜移植、胰腺与胰岛、甲状旁腺、骨髓等[9-10]。免疫抑制剂在临床上广泛应用，极大地推动了器官移植的实施并提高了移植物的存活率，改善了患者的生存质量，同时也为许多自身免疫性疾病的治疗开辟了广阔的应用前景[11]。然而，目前免疫抑制剂在应用过程中仍然存在毒副作用广泛且强烈，治疗对象和方案较局限的缺点。器官移植治疗对免疫抑制剂在防治急、慢性排斥反应、减少毒副作用方面提出了更高要求，因此，寻求高效低毒的药物是研究新型免疫抑制剂的目标。
本实验采用耳部皮肤移植到小鼠背部的方法建立了皮肤移植模型，并利用该模型对环孢素A的免疫抑制作用进行了评价。本模型中的皮肤移植手术操作简单快捷，大大减少了对动物的损伤，同时降低了感染的风险。同种移植皮肤100%存活且移植皮肤生长良好，几乎无炎症细胞浸润。对阳性对照药环孢素A的药效学评价结果表明，该模型可有效地体现环孢素A的免疫抑制作用，40 mg·kg-1的环孢素A可有效抑制免疫排斥反应，该剂量和环孢素A临床试验剂量相当，免疫抑制结果和临床结果吻合。同时，在本模型中，环孢素A明显抑制动物体重的增长，并呈现出剂量依赖性，对脾脏和胸腺也存在抑制作用，说明本模型不仅能有效地反映环孢素A的免疫抑制药效，也充分地暴露了环孢素A的副作用。
总之，本实验中建立的小鼠皮肤移植模型具有操作简单，手术成功率高，实验均一性好的优点，在有效反映免疫抑制剂药效的同时又可充分暴露药物的副作用，不失为免疫抑制剂筛选和评价的可靠模型。
( 致谢: 本实验是在中国医药工业研究总院药理评价研究中心完成。在此，向所有帮助过我的人表示最衷心的感谢！ )
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