2. 南华大学药物药理研究所，湖南 衡阳 421001;
3. 湖南中医药大学中西医结合心脑疾病防治重点实验室，湖南 长沙 410208;
4. 湖南中医药大学医学院，湖南 长沙 410208
2. Institute of Pharmacy and Pharmacology,University of South China,Hengyang Hunan 421001,China ;
3. Integrative Heart and Brain Disease Prevention and Control Laboratory,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China ;
4. School of Medicine,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410208,China
心血管疾病是一种严重威胁人类健康，特别是中老年人健康的常见病。我国每年近300万人死于心血管疾病，占全部死亡原因的40%，居各种死因之首[1-2]。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的主要发病原因，它是一种多因素导致的动脉血管病变，其中血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）异常增殖是AS形成的关键环节[3]。因此，抑制VSMC的异常增殖能够抑制血管壁肥厚，延缓动脉硬化，从而防治多种心脑血管疾病。
姜黄素（curcumin）是大部分姜科植物都含有的一种重要活性成分。研究已证实[4]，姜黄素具有抑制平滑肌细胞增殖，延缓AS发生发展的作用，但是生物利用度低限制了其临床应用。烟酸又称维生素B3，文献报道其具有明显抗AS的作用，这可能与它作用于AS病变中的细胞增殖和迁移有关[5]。但单用烟酸能引起皮肤潮红、瘙痒、胃肠道刺激等副作用。为充分发挥姜黄素和烟酸的药物疗效，克服各自缺点，实验室根据新药设计的拼合原理，合成了具有自主知识产权的新型合成化合物姜黄素烟酸酯（curcumin trinicotinate，CurTn）（专利号：ZL20091 0042665.8）。前期体内实验研究已发现姜黄素烟酸酯具有抗AS作用，但机制尚未清楚。本研究拟建立血清刺激的VSMC增殖模型，观察CurTn对体外培养VSMC增殖的影响，并初步探讨其可能机制。
1 材料与方法 1.1 药物姜黄素烟酸酯由南华大学药理植化室合成（纯度为95%以上），使用前用DMSO溶解，用DMEM培养基稀释成所需浓度于4℃储存备用。
1.2 试剂与仪器VSMC细胞株购于长沙湘雅中心实验室；姜黄素和烟酸购于上海阿拉丁试剂；胎牛血清（FBS）、DMEM购于美国Gibco公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、PD98059购于美国Sigma公司；一抗PCNA、CyclinD1、二抗山羊抗兔IgG购于美国Santa Cruz公司；一抗p-ERK1/2购于美国Cell Signaling公司；一抗β-actin、二抗山羊抗小鼠购于武汉博士得公司；一抗α-tubulin购于北京博奥森公司；ECL试剂盒购于碧云天；其他试剂均为分析纯。
1.3 方法 1.3.1 细胞培养细胞培养使用含体积分数为0.1的FBS的DMEM培养基，细胞同步化使用含体积分数为0.001的FBS的DMEM培养基，并置于37℃、5%的CO2、饱和湿度的培养箱中进行培养。
1.3.2 MTT法检测细胞活力取对数期VSMC，消化吹打成5×107·L-1的密度，每孔200 μL接种于96孔板中。待细胞贴壁后，用含体积分数为0.001的FBS的培养基同步化处理24 h。然后按不同组别的处理因素处理VSMC，同时设置调零孔（不加细胞和处理因素，加MTT和DMSO），周边孔则加入200 μL的PBS避免边缘化效应。24 h后，每孔加MTT液15 μL，继续孵育4 h。随后吸出每孔的培养液，加入200 μL的DMSO，摇床上震摇10 min，570 nm波长处检测OD值。
1.3.3 流式细胞术分析细胞周期VSMC适量接种于100 mm培养皿中，待细胞融合度达到60%~80%后，同步化处理24 h。接着按不同处理因素处理，24 h后，消化细胞，并收集于离心管中，1 000 r·min-1离心5 min，倒掉培养基，加入1~2 mL PBS，再次离心5min，倒掉PBS，用流式固定液[V(乙醇) ∶V(冰PBS) = 4 ∶1]，4℃固定过夜，流式细胞仪检测细胞周期分布。
1.3.4 Western blot检测相关蛋白表达取生长状态良好的各组细胞，用预冷的PBS洗3次，加入RIPA裂解液和PMSF的混合液，置于冰上裂解15 min，用细胞刮刮下蛋白，4 ℃、13 000 r·min-1离心15 min，吸取上清至EP管中，-80℃冰箱保存备用。蛋白质含量用BCA蛋白定量的方法进行计算。然后在提取的蛋白质中加入5×SDS凝胶上样缓冲液，沸水中煮蛋白质10 min，使其变性，4℃保存备用。配制8%~12%聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳分离（积层胶80 V，分离胶120 V），350 mA湿转PVDF膜3 h，TBST配制5%的脱脂牛奶封闭液轻摇封闭2 h，按抗体说明书的比例加入稀释的一抗，4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次15 min，按说明书稀释并加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗，37℃孵育45 min，然后用TBST洗膜4次，每次10~15 min，用化学发光显影法进行显影，以分析软件AlphaImager 2200分析产物的光密度值（灰度比值=蛋白条带灰度/内参照蛋白条带灰度）
1.4 统计学分析所有数据均用x±s表示。采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，单因素方差分析。
2 结果 2.1 姜黄素烟酸酯抑制VSMC增殖并呈现一定的量效、时效关系与对照组比较，模型组能明显促进VSMC增殖（P<0.05）；而1、3、10、30、100 μmol·L-1的CurTn则明显抑制VSMC的增殖（P<0.05），且抑制作用随浓度增加而增加（Fig 1）。30 μmol·L-1 CurTn处理24、48、72 h后，从Fig 2中可以看出，30 μmol·L-1的CurTn抑制VSMC的增殖（P<0.05），并具有时效关系。
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| Fig 1 Does effect of CurTn on the proliferation of VSMC(x±s，n=3) VSMC were treated with 10% FBS and stimulated with different concentrations of CurTn for 24 h,and then detected by MTT assay. *P<0.05 vs control；#P<0.05 vs model |
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| Fig 2 Time effect of 30 μmol·L-1 CurTn on proliferation of VSMC VSMC treated with 30 μmol·L-1 CurTn for 24,48,72 h,and then detected by MTT assay. P<0.05 vs 24 h or 72 h；#P<0.05 vs 48 h or 24 h |
用60 μmol·L-1的烟酸、30 μmol·L-1的姜黄素、30 μmol·L-1的姜黄素烟酸酯处理VSMC 24 h。如Fig 3所示，与对照组比较，体积分数为0.1的FBS明显刺激VSMC的增殖（P<0.05），溶媒组与增殖组比较未发生明显变化；单用烟酸、姜黄素和姜黄素烟酸酯均能抑制VSMC的增殖（P<0.05），而姜黄素烟酸酯抑制VSMC增殖的作用比单用单体的作用强（P<0.05）。
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| Fig 3 Effect of 30 μmol·L-1 curcumin,60 μmol·L-1 niacin and 30 μmol·L-1 CurTn on proliferation of VSMC *P<0.05 vs control；#P<0.05 vs model; △P<0.05 vs niacin or curcumin |
与对照组比较，模型组和溶媒组细胞G0/G1期比例明显降低，S期比例明显增高（P<0.05）；与模型组比较，溶媒组未有明显的改变；而姜黄素、烟酸、姜黄素烟酸酯能明显增加G0/G1期比例，降低S期比例（P<0.05）。见Tab 1。
| Group | Control | Model | DMSO | Niacin | Curcumin | CurTn |
| G0/G1/% | 62.36±3.724 | 50.21±2.685* | 51.86±3.993* | 59.72±2.612# | 58.16±4.583# | 60.21±6.250#△ |
| S/% | 27.03±4.053 | 39.36±3.417* | 38.52±1.623* | 32.16±1.603# | 28.18±5.104# | 29.61±6.726#△ |
| G2/M/% | 10.58±0.428 | 10.44±0.878* | 9.62±2.413 | 8.10±2.776# | 13.66±4.030# | 10.18±0.881#△ |
| VSMC treated with different factors for 24 h ,then detected by FCM. P<0.05 vs control; #P<0.05 vs model; △P<0.05 vs niacin or curcumin | ||||||
VSMC同步化24 h后，加入药物处理24 h。与对照组比较，模型组中PCNA蛋白表达明显上调（P<0.05）；与模型组比较，姜黄素、烟酸、姜黄素烟酸酯均能下调PCNA蛋白的表达（P<0.05）；但姜黄素烟酸酯下调PCNA蛋白的表达比单用单体作用明显（P<0.05）。见Fig 4。
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| Fig 4 Influence of CurTn on expression of PCNA in VSMC VSMC treated with different factors for 24 h,the expression of PCNA was analyzed by Western blot. *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs model; △P<0.05 vs niacin or curcumin |
VSMC同步化24 h后，加入药物处理24 h。与对照组比较，模型组中p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表达明显上调（P<0.05）；与模型组比较，姜黄素、烟酸、姜黄素烟酸酯均能下调p-ERK1/2、CyclinD1蛋白的表达（P<0.05）；但姜黄素烟酸酯下调p-ERK1/2、CyclinD1蛋白的表达比单用单体作用明显（P<0.05）。见Fig 5、6。
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| Fig 5 Influence of CurTn on expression of CyclinD1 in VSMC *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs model; △P<0.05 vs niacin or curcumin |
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| Fig 6 Influence of CurTn on expression of p-ERK1/2 in VSMC *P<0.05 vs control; #P<0.05 vs model; △P<0.05 vs niacin or curcumin |
AS是临床最常见的、由多种因素引起的动脉血管进展性狭窄性疾病，其形成的重要环节为VSMC的异常增殖。现代研究表明，姜黄素能抑制VSMC增殖，发挥抗炎、抗氧化、降血脂等作用，从而延缓AS发生发展。但因体内水溶性差、吸收少及生物利用度低等特点，限制了它在临床上的应用。烟酸作为一类调脂作用明显的药物，发现它发挥抗AS作用可能与其抑制细胞增殖有关。然而，当单用烟酸时存在着促前列腺素合成、易引起皮肤潮红、瘙痒等副作用。为改善姜黄素的生物利用度，并且保留或提高两化合物的药理作用及生物活性，本实验室将姜黄素和烟酸进行成酯拼合制成姜黄素烟酸酯。实验室前期研究发现，姜黄素烟酸酯能抑制高脂喂养的ApoE-/-小鼠AS斑块的形成，具有抗AS作用，但机制尚未清楚[6]。
本实验以大鼠VSMC为实验对象，观察CurTn对体外培养的VSMC增殖的影响。研究发现，CurTn呈剂量和时间依赖性地抑制VSMC的增殖，并且能明显降低细胞增殖核抗原（PCNA）蛋白的表达。同时结果表明，CurTn比单用烟酸或者单用姜黄素抑制VSMC增殖的作用强。
细胞增殖周期包括DNA合成前期（G1）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）以及有丝分裂期（M期）4个阶段。G1-S期和G2-M期是细胞生长周期中主要的调控点。CyclinD1是细胞周期重要的调控因子之一，当细胞周期受到外界因素刺激时，CyclinD1与Cdk4形成复合物，诱导细胞增殖。在AS病变反应中，大量的VSMC离开G0/G1期，进入细胞周期,从而进行异常的增殖，促进病变的发生[7]。为探究姜黄素烟酸酯对VSMC周期的影响，我们应用流式细胞术检测细胞周期，结果证实姜黄素烟酸酯能明显增加VSMC的G0/G1期的比例，减少G2/S期的比例，使VSMC滞留在G0/G1期，并且CurTn明显降低CyclinD1蛋白的表达，从而达到抑制细胞增殖的作用。
细胞外信号调节激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是介导信号转导至核内的重要细胞信号分子，其参与从质膜到胞核的信号转导，是细胞增殖的重要调节因素[8]。有文献报道[9]，p-ERK1/2抑制剂能降低VSMC CyclinD1蛋白的表达，CyclinD1为p-ERK1/2的下游蛋白。本实验研究发现，CurTn 也能降低p-ERK1/2蛋白的表达。
综上所述，本实验结果表明CurTn能抑制VSMC增殖，并且其比单用烟酸或者单用姜黄素抑制作用更加明显。其主要机制可能是通过下调p-ERK1/2蛋白表达，使CyclinD1蛋白的表达减少，从而减慢细胞周期G1/S期转换，细胞滞留在G0/G1期，抑制VSMC增殖。这为其作为AS疾病的防治药物提供了新的理论和实验依据。
( 致谢: 本实验主要在湖南中医药大学干细胞调控与应用实验室及南华大学药物药理研究所完成，在此对实验室各位老师及同学的帮助表示衷心的感谢！ )
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