2. 广东药学院生命科学与生物制药学院，广东 广州 510006
2. College of Life Science and Bio-pharmaceutics, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China
性影响的研究已有报道[1-3]，而其对成骨细胞活性影响的研究较为少见。该文研究阿魏酸对体外培养的成骨细胞增殖、分化功能的影响并探讨其作用机制，为当归等在防治骨质疏松症中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料阿魏酸(浙江银和药业有限公司)，新生SD大鼠(广州中医药大学实验动物中心)。Dmem培养液(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，TRIzol(Invitrogen)，茜素红(浙江温州东升化工试剂厂)，CCK-8试剂盒(碧云天生物技术研究所)，碱性磷酸酶(AKP)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)。
1.2 实验方法 1.2.1 细胞培养新生24 h内SD大鼠, 无菌条件下取出头盖骨, 剔除附着的结缔组织, 胶原酶消化后置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，取第三代细胞进行实验。
1.2.2 细胞增殖与分化实验第3代成骨细胞以1×107·L-1密度接种于96孔板, 每孔100 μL, 24 h后进行诱导培养。实验组阿魏酸浓度分别为40, 160, 640，2560 μmol·L-1, 对照组只加条件培养基。增殖实验组48 h后检测吸光度(OD), 检测波长450 nm, 参考波长630 nm。分化实验组培养48 h后, 吸弃孔中的培养液, 经裂解后收集裂解液, 检测其吸光度, 检测波长490 nm, 参考波长630 nm。
1.2.3 钙化功能检测与细胞增殖分化基因的表达成骨细胞以1×107·L-1的密度分别接种于24孔培养板和100 mm培养皿，24 h后进行诱导培养。实验分组同上。钙化功能检测组培养21 d后，镜下观察钙化结节的数量、体积及染色强度；基因表达检测组培养48 h后, 加TRIzol处理收集细胞，提取RNA进行RT-PCR试验。
1.2.4 统计学处理组间比较采用SPSS 13.0软件进行方差分析或t检验。
2 结果与对照组比较，40、160、640、2560 μmol·L-1阿魏酸均可以促进成骨细胞的增殖与分化(P < 0.05)。组间比较，细胞增殖方面，2560 μmol·L-1组可以促进成骨细胞增殖，与其他浓度组差异有显著性(P < 0.01)；细胞分化方面，除了160与640 μmol·L-1浓度之间没有差异外，其他各组间都差异存在显著性(P < 0.01)，见Tab 1，2。
| Group | Concentrtion/μmol·L-1 | OD450 |
| Control | - | 0.2760±0.0020 |
| Ferulic acid | 40 | 0.3027±0.0107*△ |
| 160 | 0.2847±0.0035*△ | |
| 640 | 0.3123±0.0040*△ | |
| 2560 | 0.3540±0.0056* | |
| *P < 0.05 vs control; △P < 0.01 vs group 2560 | ||
| Group | Concentrtion/μmol·L-1 | OD450 |
| Control | - | 0.3370±0.0004 |
| Ferulic acid | 40 | 0.3867±0.0218*△△##▲▲D |
| 160 | 0.4963±0.0146*△△D | |
| 640 | 0.4880±0.0260*△△D | |
| 2560 | 0.6027±0.0142*△△##▲▲ | |
| *P < 0.05 vs control; △△P < 0.01 vs group 40;##P < 0.01 vs group 160;▲▲P < 0.01 vs group 640;DP < 0.01 vs group 2560 | ||
40～640 μmol·L-1阿魏酸可以增加钙化结节的数量，其中40 μmol·L-1组的数量最多；而到2 560 μmol·L-1浓度时，阿魏酸则不促进钙化结节的形成。40～2 560 μmol·L-1阿魏酸促进成骨相关指标AKP、Osteopotin、Collagen-Ⅰ等基因的表达，与对照组比较，差异均具有统计学意义(P < 0.05)。
3 讨论以成骨细胞为研究对象，从中药中筛选治疗骨质疏松症可能的有效成分的研究已多有报道[4-6]，本文研究了当归等中药的有效成分阿魏酸对成骨细胞增殖、分化等功能的影响。
结果显示：40～2 560 μmol·L-1阿魏酸与对照组比，均具有刺激成骨细胞增殖的作用(P < 0.05)。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期特异性标志之一，阿魏酸4个浓度组的AKP活性均高于对照组，差异均具有统计学意义，表明阿魏酸在40～2 560 μmol·L-1浓度范围内具有促进成骨细胞分化的功能。通过Von kossa染色法检测成骨细胞钙化结节数目，可以反映细胞钙化程度[7]。在40～640 μmol·L-1浓度范围内，阿魏酸可以促进成骨细胞钙化结节的形成，而到2 560 μmol·L-1浓度时，其数量未见明显增加，这一点与AKP的结果不尽一致。钙化结节反映的是成骨细胞分化中晚期的情况，与分化早期AKP的结果不尽一致，表明2 560 μmol·L-1阿魏酸对于成骨早、晚期分化的作用存在差异，具体原因有待进一步的探讨。阿魏酸在40～2 560 μmol·L-1浓度范围内可以促进成骨相关基因AKP、Osteopontin、CollagenⅠ的表达。AKP基因检测的结果与其活性测定的数据一致，提示阿魏酸可以促进成骨细胞的分化。Osteopontin在骨基质矿化开始后开始增高，对成骨细胞与基质的吸附起重要作用[8]。CollagenⅠ是骨有机基质的主要成分，其表达与骨形成活性密切相关。40～2 560 μmol·L-1阿魏酸可以促进Osteopontin、CollagenⅠ的表达，与增值实验的结果一致，表明阿魏酸可以促进成骨细胞的增值与成熟。
综上所述，阿魏酸具有刺激体外培养的成骨细胞增殖、分化的功能，在一定浓度范围内还可以促进成骨细胞的钙化，作用机制可能与其增加成骨相关基因mRNA的表达有关。作为当归等中药的水溶性单提成分，其在防治骨质疏松症中可能具有一定的应用前景。
( 致谢: 感谢广东药学院生命科学与生物制药学院新药功能实验室贾欢欢、李英彬、张旭玲等同学给予的支持与帮助。 )
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