2. 国家苗药工程技术研究中心;
3. 贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550004
2. National Engineering Research Center of Miao's Medicine ;
3. School of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guizhou Guiyang 550004, China
中药血清药物化学是以药物化学的研究手段和方法为基础，采用现代分析方法鉴定口服中药后血清中药源性成分及移行成分，它能够直观地分析中药口服后的血液中的形态表现，快速寻找药效物质基础[1]。
头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don)又名四季红、石莽草等，属于蓼科多年生草本植物的干燥全草或地上部分[2]。其味苦、辛，性凉，归肾，具有清热利湿、利尿通淋等功效，主要用于治疗肾盂肾炎、尿道感染、膀胱炎等疾病[3-5]。但其体内作用成分及代谢过程研究还未见报道，因此本次研究采用血清药物化学研究方法，和色谱分析等手段对头花蓼进行了初步研究，为探讨头花蓼提取物在大鼠体内的主要药效物质基础和提高临床疗效奠定了科学基础。
1 材料 1.1 仪器与试药Agilent Technologies 1290 Infinity液相色谱系统；ESI-Q-TOF/MS(美国布鲁克道尔顿)；Allegra 64R低温高速离心机(美国Beckman Coulter公司)；CQ 250A-TS超声波清洗机(上海跃进医用光学器械厂)；MTN-2800D氮吹浓缩装置(天津奥特塞恩斯仪器有限公司)；EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；
头花蓼药材(购自贵州施秉头花蓼GAP种植基地，由贵州医科大学药学院生药学教研室龙庆德副教授鉴定)；对照品[没食子酸(批号MB6346)、原儿茶酸(批号MB6312)、槲皮苷(批号MB6680)，大连美仑生物科技有限公司]；金丝桃苷、陆地棉苷对照品(自制，经UV、IR、MS、1H-MNR、13C-NMR结构确证，HPLC在多个波长检测，其峰面积归一化含量均大于98.0%)；头花蓼提取物(自制，批号：20130508)；乙腈、甲酸(色谱纯，德国Merck公司)；纯净水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；其他试剂均为分析纯。
1.2 动物分组及给药健康SD大鼠，体质量为(220±20)g，由贵州医科大学动物中心提供[批号SCXK(黔)2002-0001]。♀♂各半，随机分为2组(给药组及空白组)，每组6只，分别给予头花蓼有效组分及蒸馏水，按每次87 g·Kg-1(生药量)剂量连续灌胃3 d，每天2次，空白组灌胃同等体积的蒸馏水。
2 方法 2.1 色谱条件色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18 RRHD(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，柱温：45 ℃，流动相：0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)梯度洗脱，进样体积为2 μL，梯度洗脱：(0～10 min, 5% B～45% B, 10～14 min, 45% B～95% B, 14～15 min, 95% B～100% B, 15～16 min, 100% B～5% B。
2.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI)，扫描方式为负离子扫描(ESI-，m/z 50~1 000)，毛细管电压3 KV，锥孔电压：80 V，离子源温度：110 ℃，雾化气(N2)压力：1.2 bar，流速：8.0 L·min-1，温度200 ℃，脱溶剂气温度：300 ℃，气体体积流量：50 L·h-1，脱溶剂气体积流量：550 L·h-1，准确质量测定采用甲酸钠校正标准液，校正模式选用：Enhanced Quadratic。数据分析：Data Analysis，Metabolite Detect。
2.3 供试品的制备分别于末次给药后30 min股动脉采血，取全血置于37 ℃恒温水浴上，至上层有黄色液体析出，4 ℃离心10 min，置于-20 ℃保存，备用。取大鼠血清0.5 mL，用甲醇沉淀蛋白，加入300 μL 50%甲醇水溶液溶解残留物，UHPLC-ESI-Q-TOF/MS进样分析。
3 结果在本实验色谱和质谱条件下，大鼠口服头花蓼提取物后血清样本中共检测出18个移行成分，通过与对照品对照和题组前期对头花蓼的化学成分研究[6]，确定5个为原型成分，13个可能为原型成分的代谢产物，其中1号指纹峰为没食子酸，3号指纹峰为原儿茶酸，5号指纹峰为陆地棉苷、7号指纹峰为金丝桃苷、10号指纹峰为槲皮苷，见Tab 1。
| No. | Rt/min | [M-H] | Productions | Assignment |
| M1 | 1.6 | 169.0149 | 125.0244[M-H-COO]- | Gallic acid |
| M2 | 2.2 | 262.9868 | 125.0246[M-H-SO3-COO-CH2]-183.0286[M-H-SO3]- | Gallic acid methyl sulfated metabolites |
| M3 | 2.5 | 153.0192 | 109.0295[M-H-COO]- | Protocatechuic acid |
| M4 | 5.1 | 461.1846 | 301.0349[M-H-SO3-SO3]- | Quercetin double sulfate metabolites |
| M5 | 5.3 | 463.0888 | 301.0361[M-H-C6H10O5]- | Hirsutrin |
| M6 | 5.4 | 477.0675 | 225 [M-H-C6H10O5]- | Quercetin and glucose acid metabolites |
| M7 | 5.4 | 463.0872 | 301.0353[M-H-C6H10O5]- | Hyperoside |
| M8 | 5.8 | 491.1898 | 477.1763[M-H-CH2]- | Methyl glucuronidated metabolites of Quercetin |
| M9 | 5.9 | 491.1837 | 477.1763[M-H-CH2]- | Methyl glucuronidated metabolites of Quercetin |
| M10 | 6.1 | 447.0937 | 301.0349[M-H-C6H10O4]- | Quercitrin |
| M11 | 6.7 | 505.0980 | 329.0676[M-H-C6H8O6]- | Two methyl quercetin glucuronidation metabolites |
| M12 | 7.3 | 519.0784 | 343.0441[M-H-C6H8O6]- | Three methyl quercetin glucuronidation metabolites |
| M13 | 7.8 | 519.0761 | 343.0441[M-H-C6H8O6]- | Three methyl quercetin glucuronidation metabolites |
| M14 | 8.2 | 505.0966 | 329.0676[M-H-C6H8O6]- | Two methyl quercetin glucuronidation metabolites |
| M15 | 8.7 | 519.0766 | 343.0441[M-H-C6H8O6]- | Three methyl quercetin glucuronidation metabolites |
| M16 | 9.1 | 329.0664 | - | Two methylation of quercetin metabolites |
| M17 | 9.8 | 329.0675 | - | Two methylation of quercetin metabolites |
| M18 | 11.8 | 343.0822 | - | Quercetin three methyl metabolites |
本研究建立了UHPLC-ESI-Q-TOF/ MS对血清的检测方法，其具有离子传输效率高、传输离子质量范围宽、灵敏度高、错误率低、重现性高等优点。在头花蓼提取物含药血清中检测到大量的黄酮类成分槲皮素的葡萄糖醛酸化、甲基化、硫酸化代谢产物，同时还存在酚酸类成分没食子酸、原儿茶酸的甲基化、硫酸化代谢产物等，这些成分可能为头花蓼的体内直接作用物质，对其进行深入的研究，将有助于阐明头花蓼药效物质基础及药效机制。
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