2. 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室药理与活性筛选中心，贵州 贵阳 550002;
3. 贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002
2. Center for Pharmacology and Drug Screening, Key Laboratory of Chemistry for Natural Products, Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550002, China ;
3. General Ward, Guizhou Provincial People′s Hospital, Guiyang 550002, China
微血管内皮细胞具有重要的生理功能[1]。诸多因素会损伤微血管内皮细胞，从而导致微血管内皮功能的失衡，进而引起多种病征和损伤[2]。其中，药物损伤是一个重要的因素。绿原酸(chlorogenic acid, CGA)是金银花、杜仲等药材中的重要活性成分，也是诸多中药民族药的质量控制的主要指标之一，同时也是具有重要应用开发前景的活性物质[3]。CGA具有清除氧自由基、抗炎、抗病毒、降血压、抗肿瘤等作用[4]。CGA在体内除了本身具有活性外，其代谢产物咖啡酸、阿魏酸也是其活性的重要物质基础[5]。本文研究了绿原酸、咖啡酸、阿魏酸对人微血管内皮细胞的损伤作用。
1 材料与方法 1.1 材料人微血管内皮细胞(human microvascular endothelial cells，HMEC)由本实验室传代培养；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Hoechest 33342和PI染色液为碧云天生物研究所产品；绿原酸(chlorogenic acid，CGA)、咖啡酸(caffeic acid，CA)、阿魏酸(ferulic acid，FA)购自美国Sigma公司；其余试剂均为符合实验要求的分析纯。
1.2 方法 1.2.1 MTT法测定CGA、CA和FA对细胞活力的影响按照文献[6]方法进行测定。
1.2.2 CGA、CA和FA对LDH释放的影响将HMEC以1×104 cells·well-1，接种于96孔板，培养24 h后弃上清，分别加入1.0 mmol·L-1的CGA、CA和FA处理6、12、24 h后，取适量上清，按试剂盒说明书检测和计算LDH活性。
1.2.3 CGA、CA和FA诱导HMEC凋亡的作用将HMEC以1×104 cells·well-1，接种于96孔板，培养24 h后弃上清，分别加入1.0 mmol·L-1的CGA、CA和FA处理6、12、24 h后弃上清，按试剂盒说明书加入染色液，在高内涵筛选系统(CellInsightTM CX5，美国Thermo公司)上分析与检测。
1.2.4 统计学分析实验检测数据以x±s表示，以SPSS 19.0进行单因素方差分析。
2 结果 2.1 CGA、CA和FA对人微血管内皮细胞活力及形态学的影响MTT法检测结果显示，1.0、3.0、5.0 mmol·L-1的CGA、CA和FA对细胞活力有明显的抑制作用(Tab 1)，表明一定剂量的CGA、CA和FA对内皮细胞有损伤作用。形态学观察表明，未经处理的细胞呈铺路石状贴壁生长；经CGA处理后，部分细胞变圆，细胞间隙变大；CA组细胞变圆，部分细胞解离悬浮；FA组细胞呈细长状，棱角变多，少量细胞悬浮。
| Group | Cell viability/% | ||||
| 0.1 mmol·L-1 | 0.5 mmol·L-1 | 1.0 mmol·L-1 | 3.0 mmol·L-1 | 5.0 mmol·L-1 | |
| CGA | 110.25±19.41 | 125.34±12.86 | 76.66±17.64 | 33.19±12.65* | 18.31±13.62** |
| CA | 96.52±1.23 | 101.70±7.16 | 63.09±15.43 | 37.08±16.95 | 21.84±7.17* |
| FA | 89.57±10.50 | 87.09±9.89 | 68.54±10.12 | 60.40±10.43* | 38.13±0.77** |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs 1.0 mmol·L-1 group. | |||||
LDH测定结果显示(Tab 2)，HMEC经1.0 mmol·L-1的CGA、CA和FA处理后，24 h时间点的细胞上清中LDH活性明显增加(P < 0.01)；而在6、12 h上清中LDH活性没有明显的上调。
| Group | LDH activity/U·L-1 | ||
| 6 h | 12 h | 24 h | |
| Control | 27.62±20.19 | 53.52±11.88 | 97.54±20.94 |
| CGA | 28.35±18.45 | 63.66±27.24 | 176.85±32.89**## |
| CA | 27.82±5.96 | 61.28±26.76 | 223.65±32.33**## |
| FA | 59.42±20.78* | 44.14±18.28 | 141.38±22.33**## |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control; ##P < 0.01 vs 6 h | |||
高内涵筛选系统检测与分析结果显示(Tab 3)，CGA、CA和FA处理的细胞发生了不同程度的凋亡，其中，CGA、CA组的凋亡比较明显，FA组细胞凋亡率相对较低。
| Group | Apoptosis/% | ||
| 6 h | 12 h | 24 h | |
| Control | 7.08±3.55 | 8.33±1.41 | 9.23±2.77 |
| CGA | 18.25±10.63 | 18.62±0.57* | 68.37±15.15**## |
| CA | 10.90±3.13 | 28.69±6.81**## | 67.35±2.31**## |
| FA | 18.09±9.68 | 27.42±8.59** | 41.65±3.23**# |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs control；#P < 0.05, ##P < 0.01 vs 6 h | |||
CGA经口服后，其在体内的代谢产物主要是CA、FA等[7]。本文基于代谢角度开展了CGA、CA和FA对微血管内皮细胞的损伤作用的研究，结果表明一定剂量的CGA、CA和FA对人微血管内皮细胞有损伤。
不同浓度的CGA、CA和FA筛选实验表明，1.0、3.0、5.0 mmol·L-1的CGA、CA和FA对细胞有明显的损伤作用，这种损伤有量效关系。从细胞形态来看，细胞经CGA、CA和FA处理后细胞收缩，间隙变大。FA组细胞形态类似分化的PC12细胞，明显有别于CGA、CA组。这种形态学的差异提示CGA、CA和FA对内皮细胞作用机制存在差异，为进一步研究CGA、CA和FA的作用机制提供了依据。LDH测定结果表明，在6、12 h没有明显变化，在24 h时间点LDH活性明显增加。高内涵筛选系统上检测与分析的结果显示，各处理组细胞的凋亡比例明显升高，表明一定剂量的CGA、CA和FA能够诱导内皮细胞发生凋亡，这个结果也解释了LDH上调的原因。
本研究表明一定浓度的CGA、CA和FA在体外对微血管内皮细胞有损伤作用，提示其在体内一定条件下可能会对血管内皮产生损伤作用。本研究对进一步研究CGA及含有CGA药物的用药安全性有一定的参考价值。
( 致谢: 本文实验是在贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室药理与活性筛选中心孙黔云研究员实验室完成，在此深表感谢！ )
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| [3] | 曹旭, 谢玉敏, 朱迪, 等. 杜仲提取物中五个成分血浆蛋白结合率的测定[J]. 中国药理学通报, 2015, 31 (1) : 131-5. Cao X, Xie Y M, Zhu D, et al. Determination of plasma protein binding rate of five components in Eucommia ulmoides extract[J]. Chin Pharmacol Bull, 2015, 31 (1): 131-5. |
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| [5] | Wu C, Luan H, Zhang X, et al. Chlorogenic acid protects against atherosclerosis in ApoE-/- mice and promotes cholesterol efflux from RAW264.7 macrophages[J]. PLoS One, 2014, 9 (9): e95452. doi:10.1371/journal.pone.0095452 |
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| [7] | Gonthier M P, Verny M A, Besson C, et al. Chlorogenic acid bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats[J]. J Nutr, 2003, 133 (6): 1853-9. |