2. 上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032
2. Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
MSCs是一种易于扩增、具有分化为各种不同细胞潜能的干细胞，也是一种优良的种子细胞。它可分化为：脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、生肌细胞、甚至神经细胞等[1]。维生素D，目前认为它是一种前类固醇激素。作为激素分子的作用机制是[2]：1, 25(OH)2D3从血清维生素D结合蛋白或其他转运蛋白中分离出来，进入细胞内，与维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)结合后，通过基因调节的方式发挥防治骨质疏松症、儿童佝偻病、成人软骨症、关节痛等作用。作为体内MSCs分化的重要调节因子[3-5]，本文综述了维生素D通过Wnt信号通路、Wnt5a/ROR2轴、BMP/TGF-β/Samd信号通路、ROS/ERK信号通路调控MSCs成骨分化的分子作用。
2 维生素D通过Wnt信号通路促进MSCs成骨分化Wnt蛋白最早是由Nusse在1982年通过果蝇基因与小鼠的INT-1基因组合而来。Wnt蛋白家族富含L-半胱氨酸，在进化中高度保守[6-7]。目前已经知道细胞膜外Wnt蛋白共有19个成员，其中Wnt1、Wnt3a、Wnt4、Wnt7a、Wnt7b等参与Wnt/β-catenin信号途径，又称Wnt经典途径，这些蛋白与LRP/FZD结合而发挥协同作用，激活Wnt/β-catenin经典通路[8]。Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt11等参与Wnt/Ca2+和Wnt/PCP通路，又称非经典Wnt途径，这些信号分子能与Frizzled结合而激活异源三聚体G-蛋白，提高细胞内钙水平和建立细胞极性、骨架重排等作用[9]。
2.1 维生素D通过Wnt经典途径促进MSCs成骨分化临床与分子生物学研究资料已经证实VDR在维生素D生物学作用中具有极其重要的意义，活性维生素D主要是通过与VDR结合发挥其生物学作用[10]。在肾脏中，1, 25(OH)2D3作为VDR的配体，激素-受体复合物对钙磷代谢产生影响，导致矿物质在骨中沉积和重塑。在骨组织中，1, 25(OH)2D3通过Wnt经典途径促进MSCs成骨分化[11]。近年来，许多科学家利用VDR(-/-)小鼠来研究维生素D对MSCs分化的影响。有研究显示[12-14]，1, 25(OH)2D3与VDR结合后释放的因子使Wnt信号通路的抑制因子DKK1、SFRP2活性降低，Wnt受体LRP5表达量增高，同时MSCs分化为成骨细胞的能力恢复正常。另外，Cianferotti等[12]发现相比于野生型小鼠，VDR(-/-)小鼠MSCs分化为脂肪细胞的数量增加，抑制因子DKK1和SFRP2活性增加，LRP5表达量降低。DKKs、SFRPs可以阻碍Wnt蛋白与其受体LRP结合[15]，运用基因工程的手段使编码DKK1的一个等位基因突变，另一个等位基因正常表达，进而使DKK1表达降低，低表达的DKK1增加了骨形成，然而在大鼠颅骨成骨细胞中的DKK1过表达会增加脂肪细胞的分化。因此1, 25(OH)2D3可能通过降低DKK1和SFRP2的活性，上调LRP5来激活Wnt信号通路，促进MSCs的成骨分化。
2.2 维生素D通过Wnt5a/ROR2轴促进MSCs成骨分化Wnt5a是Wnt家族成员之一。Wong等[16]根据Wnt家族成员对小鼠细胞C57MG转化能力的高低将Wnt分为2组，其中高转化能力组Wnt可激活β-catentin依赖性通路；弱或无转化功能的Wnt包括Wnt5a等，不依赖β-catentin介导的转录激活，Wnt5a和FZD2可调节细胞内Ca2+的浓度和流向，从而激活Ca2+依赖性的一些通路，在某些特定情况下，Wnt5a也可以激活经典信号通路，调节骨代谢[17]。有研究发现[18]，1, 25(OH)2D3可以干扰Wnt5a/ROR2轴，促进MSCs分化为成骨细胞。Wnt5a与不同的受体结合后，激活或抑制Wnt经典信号通路。Wnt5a与ROR2结合会通过非GSK3依赖途径阻碍β-catentin的表达，从而抑制Wnt通路，阻滞MSCs向成骨细胞分化[19]。Wnt5a激活经典途径还是非经典途径，不是由Wnt5a本身决定，而是在某种细胞的背景下，由相应受体的表达情况决定[20]。Tornero-Esteban等[21-22]通过对人的MSC细胞培养实验发现，1, 25(OH)2D3可以与Wnt5a竞争性结合ROR2，迅速上调PKC，CaMKII活性。活化的PKC，CaMKII会激活Wnt5a与FZD4或FZD2、FZD5结合，产生活化因子，激活Wnt信号通路，促进MSCs向成骨细胞分化。
3 维生素D通过BMP/TGF-β/Samd信号通路促进MSCs成骨分化TGF-β家族的受体有Ⅰ、Ⅱ型2种，为受体丝氨酸/苏氨酸激酶形成的异源二聚体。与之相对应的信号通路也有2种，一种称之为TGF-β信号通路，另一种称之为BMP信号通路。这两条信号通路的配体分别与细胞膜上的Ⅰ、Ⅱ型受体结合，然后再通过Samds向细胞核内传递信号[23-24]。其中I型受体又被称为激活素受体样激酶(activin receptor -like kinase, ALKs)，包括了ALK1和ALK5等7个激活素受体样激酶，在Ⅱ型受体(TβRⅡ、BMPRⅡ等)下游发挥作用[25]。
3.1 维生素D通过BMP/Samd信号通路促进MSCs分化为成骨细胞在MSCs成骨分化过程中，异三聚复合物P-Smad1/5/8-Smad4、Runx2、Osx[26-27]被认为是重要的调控因子。研究发现[28]，在体外培养的SLE病人的MSC中加入维生素D类似物(EB1089)后，MSCs成骨分化能力增强。众所周知，Smad信号通路是介导TGF-β从细胞表面到细胞核的关键，而EB1089可以上调P-Smad1/5/8活性，引起P-Smad1/5/8-Smad4表达增强，P-Smad1/5/8-Smad4转位到细胞核与靶基因上的增强子序列结合，上调Runx2和Osx活性，进而促进MSC成骨分化。另有研究发现[29]，体外诱导MSCs分化时，1, 25(OH)2D3能明显上调MSC成骨分化的特异性标志物Ocn表达和ALP活性。Honda等[29]用TB、m4T5、m8T11等不同的混合培养液对小鼠骨髓的MSCs进行体外培养后发现，含有100 μg·L-1 BMP-2的TB、12.5 μg·L-1 BMP-2的m4T5和1, 25(OH)2D3的m8T11均能上调Ocn与ALP活性，促进MSCs向成骨细胞分化。但当分别加入抑制剂Noggin(阻碍BMPs与受体的结合)，Dorsomorphin(抑制BMP介导的Smad活性)对小鼠骨髓的MSCs进行培养后发现，在都含有Noggin的TB和m4T5中，MSCs向成骨细胞分化的程度降低，而在含有Noggin的m8T11中，Ocn、Runx2、Osx和ALP活性仍较高，MSCs向成骨细胞分化明显；在都含有Dorsomorphin的TB、m4T5和m8T11中，MSCs向成骨细胞分化的程度明显降低。因此1, 25(OH)2D3可能会激活BMP-2或与BMP-2在BMP/Samd信号通路中有相似作用。
3.2 维生素D通过TGF-β/Samd信号通路促进MSCs分化为成骨细胞组蛋白H3K9ac和H3K9me2也是MSCs成骨分化的重要调控因子。Tan等[30]运用全基因组表达启动子微阵列芯片技术发现，在人的髂骨骨髓MSCs成骨分化过程中，H3K9ac减少，H3K9me2增加。随后又对人的髂骨骨髓MSCs进行成骨诱导体外培养，通过基因芯片技术分析后发现，VDR在H3K9ac和H3K9me2影响MSCs成骨分化过程中起着反式抑制作用，1, 25(OH)2D3与VDR结合可以促进蛋白的甲基化靶点(H3K9)的脱乙酰作用和二甲基化作用，脱乙酰基和二甲基化的H3K9，下调H3K9ac，上调H3K9me2，进而下调TGF-β信号通路THBS1、PITX2、ID1、RBL1、INHBA的表达[31]，促进MSCs的成骨分化。综上，维生素D可以通过BMP/TGF-β/Samd信号通路促进MSCs分化为成骨细胞。
4 维生素D通过ROS/ERK信号通路促进MSCs成骨分化活性氧(reactive oxygen species, ROS)是MSCs分化的重要调节者，而激活ERK和p38 MAPK信号转导可以促进大鼠MSCs增值[32]，可见ROS和ERK在骨稳态维持过程中起着重要作用。研究发现[33-37]，1, 25(OH)2D3可以上调人MSCs中CYP27B1(1-OHase)，使25(OH)D3转化为活性维生素D-1, 25(OH)2D3，过转化的1, 25(OH)2D3通过抑制过氧化氢酶上调ROS表达，同时下调MSCs中CYP24A1(24-OHase)，阻滞25(OH)D、1, 25(OH)2D3由24-OHase催化而失活[38-40]。在体外培养的人椎骨MSCs中加入1, 25(OH)2D3后ROS表达上调，ROS作为特定的信号分子，能够直接使目标蛋白氧化，随着氧化作用的积累，ROS通过模仿生长因子受体-配体的交互作用直接激活下游ERK，活化的ERK使Runx2磷酸化，引起Runx2过表达，进而促进MSCs的成骨分化[37]。
5 结语MSCs是有多向分化潜能的干细胞，能在体外增殖，维持非分化状态并具有分化成骨、软骨、脂肪、纤维及骨髓基质等中胚层组织的潜能，对骨骼的发育和代谢平衡具有十分重要的作用，是目前研究及关注较多的种子细胞之一。随着年龄的增长和绝经后骨质疏松症的发生、发展，骨髓腔内的成骨细胞减少，脂肪细胞增多，因此促进MSCs成骨分化是目前治疗骨质疏松症的新途径。维生素D通过不同的信号通路促进MSCs分化为成骨细胞(Fig 1)，系统探讨其分子作用机制，为开发治疗骨质疏松新药、建立新方法奠定了理论基础。
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| Fig 1 Molecular signaling pathway of regulatory effects of vitamin D on osteogenic differentiation of MSCs |
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