2. 贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心;
3. 贵州医科大学药学院;
4. 贵州医科大学国家苗药工程技术研究中心,贵州 贵阳 550004
2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicine and TCM (Ministry of Education), Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China ;
3. College of Pharmacy, Guizhou Medical University ;
4. National Engineering Research Center of Miao Medicine, Guiyang 550004, China
赤芍为毛莫科植物川赤芍Paeonin veitchii Lynch的干燥根，具有清热凉血、散癖止痛等功效。现代药理研究表明，赤芍具有扩张血管、解热解痉、抗血栓形成等药理作用。芍药苷是芍药总苷的主要成分[1]，具有赤芍上述的药理功效，但研究发现芍药苷的胃肠吸收很差，生物利用度低[2]，限制了其临床应用。本研究利用 Caco-2 细胞模型[3-4]对赤芍主要成分芍药苷、苯甲酰芍药苷进行体外吸收特性的初步研究，旨在为赤芍的进一步开发提供理论依据。
1 材料 1.1 仪器与试药超高液相色谱色谱-三重四级杆质谱联用仪(美国Waters公司)；二氧化碳培养箱(Thermo scientific)；超净工作台(苏州净化设备总厂)；illicell-ERS电位仪(美国Millipore公司)；功能酶标仪(Thermo3001 VARIOSKAN FLASH)；倒置相差显微镜(日本Olympus)。
苯甲酰芍药苷(批号：20120315) 、芍药苷(批号：S12-100819) 、葛根素(批号：110752-200912) ；赤芍提取物，自制(批号：20120615) ；Hank’s缓冲溶液(HBSS, Gibco)；胰蛋白酶(trypsin，Sigma)；考马斯亮蓝(批号：20130523，南京建成生物工程研究所)。
1.2 细胞株Caco-2细胞株(上海中科院)，实验用的细胞传代数在50代以内。
2 方法 2.1 色谱条件Waters Acquity BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱温：45℃，0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脱，梯度为0～2 min: 5%～25%，2～3 min：25%～95%，4 min:5%；流速为0.35 mL·min-1；进样体积为1 μL。
2.2 质谱条件电喷雾电离源(ESI)；离子源温度：120 ℃；毛细管电压：3 kV；去溶剂气温度：350 ℃；碰撞气为Ar(0.16 mL·min-1)；去溶剂气为N2(650 L·h-1 )；扫描方式为多反应离子监测模式(MRM)。苯甲酰芍药苷：m/z 583.3、芍药苷：m/z 525.2及葛根素：m/z 417.0。
2.3 样品处理参照文献[2]，取250 μL细胞悬液加入400 μL乙腈沉淀蛋白，涡旋2 min，15 000 r·min-1离心10 min，取上清液1 μL进样分析；另取10 μL细胞悬液以考马斯亮蓝法测定蛋白含量。摄取量以 mg(药物)·g-1(蛋白)表示。
2.4 细胞的毒性研究(MTT法)参照文献[5]，进行Caco-2细胞的培养及细胞毒性试验。正常对照组每孔加入100 μL DMEM培养液；考察组分别加入100 μL不同浓度的空白溶剂DMSO(2.5、5、10、20、30) 、HBSS缓冲溶液(pH 4、6、7.4) 、不同浓度的赤芍提取物(0.1、1、5、15、30 mg·L-1)及P-gp抑制剂维拉帕米(25、50、100、200、400 mg·L-1)和环孢菌素A(5、25、50、100、200 mg·L-1)，考察受试物的细胞毒性。
2.5 赤芍提取物的细胞摄取特性研究参照文献[6-7]进行Caco-2细胞的培养及细胞摄取影响因素考察实验，分别考察培养时间(15、30、60、90、120、180 min )、不同赤芍提取物浓度(0.2、1、2.5、5、7.5 g·L-1)、培养介质不同pH(4.0、6.0、7.4) 、P-糖蛋白抑制剂(维拉帕米、头孢菌素A)及不同温度(4 ℃、25 ℃、37 ℃)对赤芍提取物中两种有效成分在Caco-2细胞中摄取的影响。
2.6 统计学分析统计分析所得数据以x±s表示，组间差异比较用F检验。
3 结果 3.1 Caco-2细胞毒性研究实验结果表明，在实验范围内各受试物对Caco-2细胞生长无不良影响。
3.2 浓度依赖性摄取实验在0.6～7.5 g·L-1内芍药苷和苯甲酰芍药苷的细胞摄取量与浓度呈线性关系，回归方程分别为为Y=0.1267X-0.1556，r2=0.9745；Y=0.0285X-0.0622，r2=0.8978；表明芍药苷和苯甲酰芍药苷的摄取主要表现为被动扩散，见Tab 1。
| Concentration/g·L-1 | Drug uptake/mg·g-1 Pro | |
| Paeoniflorinand | Benzoylpaeoniflorin | |
| 0.2 | 0.03±0.01 | 0±0 |
| 1 | 0.14±0.01 | 0.01±0 |
| 2.5 | 0.29±0.06 | 0.03±0 |
| 5 | 1.05±0.06 | 0.15±0.02 |
| 7.5 | 1.83±0.41 | 0.42±0.12 |
在不同的摄取时间下，芍药苷和苯甲酰芍药苷的细胞摄取量都随着时间的增加而增加。
3.4 pH值对Caco-2细胞摄取的影响在pH 4.0、6.0、7.4条件下，芍药苷和苯甲酰芍药苷的细胞摄取量随pH增加而降低。其中苯甲酰芍药苷在pH 7.4条件下药物的细胞摄取量明显低于pH 6.0(P＜0.05) ，表明碱性环境相对不利芍药苷和苯甲酰芍药苷的吸收，见Tab 2。
| pH | Drug uptake/mg·g-1 Pro | |
| Paeoniflorinand | Benzoylpaeoniflorin | |
| 4 | 4.27±0.79 | 0.84±0.34 |
| 6 | 4.5±0.43 | 0.93±0.06 |
| 7.4 | 1.87±0.11* | 0.39±0.02* |
| *P＜0.05 vs pH 6 | ||
芍药苷和苯甲酰芍药苷的细胞摄取量都随着温度的增加而增加，且苯甲酰芍药苷的摄取随温度(4 ℃与37 ℃)增加，差异有显著性(P＜0.05) ，见Tab 3。
| Temperature/℃ | Drug uptake/mg·g-1 Pro | |
| Paeoniflorinand | Benzoylpaeoniflorin | |
| 4 | 1.77±0.57 | 0.28±0.1 |
| 25 | 1.91±0.07 | 0.35±0.02 |
| 37 | 2.49±0.65 | 0.5±0.09* |
| *P＜0.05 vs 4 ℃ | ||
采用SPSS 18.0软件，经单因素方差分析，结果显示抑制剂对芍药苷及苯甲酰芍药苷的细胞摄取无明显影响。
4 讨论本实验研究标明，在0.2~7.5 g·L-1范围内，芍药苷、苯甲酰芍药苷的细胞摄取表现出一级速率过程的特征，表明赤芍提取物的摄取机制可能为被动扩散。药物摄取受时间、浓度、pH的影响。在中性、偏碱性条件下，药物的摄取明显降低，可能是由于中性、偏碱性条件下二者分子中的酯基水解，导致膜渗透性降低。环孢菌素A和维拉帕米对二者在Caco-2细胞中的摄取量没有明显增加作用，提示芍药苷和苯甲酰芍药苷可能不是P-gp底物。
| [1] | 黄勇, 王永林, 兰燕宇, 等. 注射用辛芍对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用和对脑微循环血流量的影响[J]. 中国新药杂志, 2008, 17 (2) : 119-23 . Huang Y, Wang Y L, Lan Y Y, et al. Effect of Xinshao injection on cerebral ischemia-reperfusion injury and regional cerebral blood flow in rats[J]. Chin J New Drug, 2008, 17 (2) : 119-23 . |
| [2] | 杨祖贻, 裴瑾, 刘荣敏, 等. 温里药配伍提高赤芍效应成分芍药苷生物利用度的研究[J]. 中国中西医结合杂志, 2005, 25 (9) : 822-4 . Yang Z Y, Pei J, Liu R M, et al. Study on enhancing bioavailability of Paeoniflorin by combined use with Chinese herbs for inner-warming[J]. Chin J Integr Trad West Med, 2005, 25 (9) : 822-4 . |
| [3] | Allen R H, Rober t A C, Philip S B. Caco-2 cell mo nolayers as a model for drugt ransport across the intestinal mucosa[J]. Pharm Res, 1990, 7 (9) : 902 doi:10.1023/A:1015937605100. |
| [4] | 李晓军, 王素军, 王广基, 等. HPLC-MS法测定关附甲素及其在Caco-2细胞上的摄取性[J]. 中国药理学通报, 2013, 29 (2) : 286-9 . Li X J, Wang S J, Wang G J. HPLC-MS determination of GFA and its uptake in Caco-2 Cells[J]. Chin Pharmacol Bull, 2013, 29 (2) : 286-9 . |
| [5] | 蓝燕宇, 刘跃, 曹旭, 等. 杜仲中4种主要成分在Caco-2细胞的摄取特性研究[J]. 中国药理学通报, 2014, 30 (9) : 1306-11 . Lan Y Y, Liu Y, Cao X, et al. Uptake of Eucommia ulmoides extract in Caco-2 cell monolayer[J]. Chin Pharmacol Bull, 2014, 30 (9) : 1306-11 . |
| [6] | 杨秀伟, 张鹏, 吴琦. 羌活中二氢呋喃类香豆素在人源肠Caco-2细胞单层模型的吸收转运研究[J]. 中草药, 2009, 40 (5) : 748 . Yang X W, Zhang P, Wu Q. Absorption and transportation characteristic of dihydrofurocoumarins from Rhizome et Radix Notoperygii in a model of Caco-2 cell monolayer[J]. Chin Tradit Herb Drugs, 2009, 40 (5) : 748 . |
| [7] | 沙先谊, 方晓玲, 吴云娟. 9-硝基喜树碱在Caco-2 细胞模型中的体外摄取、转运及外排动力学[J]. 药学学报, 2004, 39 (10) : 839 . Sha X Y, Fang X L, Wu Y J. The in vitro kinetics of uptake, transport and efflux of 9-nitrocamptothecin in Caco-2 cell model[J]. Acta Pharm Sin, 2004, 39 (10) : 839 . |