全细胞膜片钳技术是研究离子通道和药物对离子通道影响的最重要的技术之一，但是由于其对实验技术要求高，对实验标本制备和实验环境、实验用溶液等条件均有严格要求等原因致使其在实际运用中较为困难。本文报告了运用全细胞膜片钳技术进行神经元钙通道药理研究的一些经验。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物和试剂

孕期(19±1) d清洁级的SD大鼠由中国科学院上海生命科学院动物中心提供，人参皂苷Rb1购自吉林大学基础医学院有机化学实验室。nifedipine、BayK8644、glutamate等购自美国Sigma公司，溶液中的电解质均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器

MP-285微操纵仪(Burleigh, 美国)，CCD Evolution QEi (monochrome)(Media Cybernetics， 加拿大)，EPC9 triple放大器、Patchmaster2.1数据采集分析软件(Heka, 德国)，P-97电极拉制仪(Sutter Ins, 美国)。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

海马神经元的混合培养参照Zhang等^[1]的方法并稍加改进。取d 7的细胞用于电生理记录。

1.2.2 电生理记录

电极内液包括：80 mmol·L^-1 Cs-methanesulfonate, 20 mmol·L^-1 tetraethylammonium chloride(TEA-Cl), 1 mmol·L^-1 CaCl₂, 5 mmol·L^-1 MgCl₂, 11 mmol·L^-1 EGTA, 10 mmol·L^-1 HEPES, 10 mmol·L^-1 Na₂ATP；用CsOH将pH调整至7.2~7.3，用蔗糖将渗透压调至300 mOsm。 细胞外液包括：115 mmol·L^-1 choline-Cl, 25 mmol·L^-1 TEA-Cl, 5 mmol·L^-1 4-aminopyridine(4-AP), 5 mmol·L^-1 BaCl₂, 10 mmol·L^-1 glucose, 10 mmol·L^-1 HEPES, 0.000 5 mmol·L^-1 tetrodotoxin(TTX)；用Tris将pH调整至7.2~7.3，用蔗糖将渗透压调至300 mOsm。本实验记录的是电压门控的钙通道钡电流(voltage-gated calcium channel Ba²⁺current, IBa)，采用钳制电压设定在-50 mV，阶梯式给予从-70 mV到+70 mV指令电压的激活程序，从-60 mV去极化到0 mV的药物作用程序。

1.2.3 实验给药及处理

细胞外灌流使用改良的Y管给药装置^[2-3]。形成全细胞记录模式^[4]后，开启Y管给药装置，从细胞一侧微灌流事先配制好的含所需药物浓度的细胞外液，所有细胞均在细胞破膜后3～5 min记录到的电流稳定时才给药。

1.2.4 电生理记录的分析数据分析

用Patchmaster2.1软件进行处理，做图用Origin8.0软件。实验数据以x±s表示，采用SPSS17.0软件包分析。同一药物浓度组内均值比较采用配对t检验。

2 结果 2.1 适合膜片钳记录的原代培养神经元

以60 000 cells·mL^-1的密度种植于培养皿中经7 d培养后的神经元，在相差显微镜下观察有活力的神经细胞一般具有形状近似锥形或三角形、表面完整光滑、胞体均一明亮、周围光晕明显等特点。

2.2 药理研究的给药系统

Y管给药装置中Y管给药尖端距离目标细胞50～100 μm，药液高于Y管口30～50 cm以便其有足够的重力流出。实验中给药尖端的位置以100 μmol·L^-1谷氨酸作为参照，通过“Y-tube”灌流100 μmol·L^-1谷氨酸诱导出一个快速的内向电流及随之的稳态电流，洗脱后基本恢复至基线。

2.3 电压门控的钙通道电流的记录

在本实验条件下，通过在细胞内外液中分别加入特异性的抑制剂，电压门控的钠电流及钾电流被阻断；将钳制电压设定在-50 mV，阶梯式给予指令电压可记录到一束内向Ba²⁺电流。记录到的内向Ba²⁺电流对L-型通道特异性的抑制剂硝苯地平和L-型通道激动剂BayK8644反应灵敏。

2.4 药物对电压门控的钙通道的影响

细胞外灌流20 μmol·L^-1人参皂苷Rb1，IBa²⁺峰电流密度值(pA/pF)分别比给药前降低(23±3.49) %(n=3, P>0.05) 。Rb1对钙电流的阻断是可逆的，在洗脱后几乎回复到基线。加入20 μmol·L^-1人参皂苷Rb1后，最大的电流峰值由加药前的(721.60±53.63) pA减少至(556.00±50.70) pA。Rb1明显减少神经细胞的IBa²⁺峰值(P＜0.01, n=3) 。同时Rb1对VGCC激活电位及反转电位均无明显影响。

3 讨论

神经细胞的制备、细胞封接和破膜、给药系统的配置等诸多环节均可影响膜片钳实验的成败。我们先前的实践证实在本培养系统下，培养的海马神经元既保留了钙通道的电生理特性^[5]，又克服了急性分离后状态好的细胞数量有限、细胞状态难以长时间保持等缺点；细胞在破膜记录到稳定电流后仍能保持较好的状态，有利于药物干预后较长时间的观察。

Y管给药装置可自制，材料价格低廉，易于安装。Y管给药使我们能迅速准确地观察到通道对药物的反应以及其随时间变化的趋势，也实现了在同一细胞上序贯给予多种药物干预的可能；使状态好的细胞得到了更高效地利用^[2-3]。我们记录了20 μmol·L^-1 Rb1对VGCC的影响以及电流在药物作用前后随时间的变化，在此基础上通过对电流-电压关系曲线图的分析可以了解Rb1对VGCC激活电位、最大激活电位及反转电位的影响；或者药物对稳态激活曲线和稳态失活曲线的影响^[6]；从而客观分析药物对通道功能状态的影响。

( 致谢: 感谢浙江大学医学部段树民教授给予的技术指导！ )